高效液相色譜法測定三種蟲草發酵液與菌絲體核苷化合物含量

孫忠華，肖建輝，遲 強，范成路，徐珺陽，林志平

1中國人民解放軍第215 醫院全軍心理衛生中心睡眠調整中心，大連 116041;2遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，遵義 563003

蟲草屬真菌是我國的一種傳統中藥材，屬于大型真菌類，在我國很多地區都有分布，其中以冬蟲夏草(Cordeceps sinensis)最為名貴。然而由于天然蟲草資源緊缺，且無節制的采集會破壞生態平衡，利用蟲草無性型進行液態深層發酵所得菌絲體是一種良好的替代品，而且應用發酵工程的技術可以縮短蟲草的生產周期，增大蟲草菌絲體的產量［1，2］。目前，許多研究已經證明蟲草的多種成分具有明確的藥理活性，如免疫調節、抗腫瘤、抗氧化及調節腎臟和肝臟功能等［3］。蟲草屬真菌中的有效活性成分比較多，其中核苷類化合物是其中的一類重要成分，在真菌發酵液中，人們的興趣多集中于菌絲體，而其多種次生代謝產物可能同時會富集于胞外，但目前未見對胞外部分核苷類化合物含量測定。另外，傳統的紫外檢測方法僅以樣品色譜行為的保留時間作為定性指標而缺少光譜數據，從而增加了檢測結果的不確定性［4］。江西蟲草(Cordyceps jiangxines)、古尼蟲草(Cordyceps gunni)、戴氏蟲草(Cordyceps taii)是我國梁宗琦研究組在全國蟲草資源調查時，發現的三個蟲草屬新記錄［5-6］。本研究擬對蟲草發酵液(包括菌絲體和胞外發酵液部分)中五種重要核苷類化合物的含量進行測定，并以保留時間和吸收光譜雙指標作為定性依據，建立蟲草中核苷類化合物的定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

標準品:腺苷(批號:046K0661)、蟲草素(批號:054K4053)、尿苷(批號:1181124)、肌苷(批號:080912)、鳥苷(批號:450233)(均為Sigma 產品);甲醇(色譜級，Tedia，美國);超純水(Millipore)。

1.2 儀器與設備

全溫振蕩培養箱(QHZ-98A，江蘇太倉華美儀器廠);旋轉蒸發儀(Buchi，瑞士);數顯鼓風干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊公司);超聲破碎儀(Soniprep150，SANYO MSE，英國);Centrifuge 5804R 型冷凍高速離心機(Eppendorf，德國);Milli-Q Biocel 超純水制備系統(Millipore，美國);超聲儀(Grant XB14，英國);電子天平(精確到0.1 mg，BP121S，Sartorius，德國);LC-20A 型高效液相色譜儀(DAD detector，Shimadzu，日本)。

1.3 供試品制備

江西蟲草、古尼蟲草、戴氏蟲草三種真菌的菌種保藏在貴州大學真菌研究室和遵義醫學院貴州省細胞工程重點實驗室。

樣品的制備:采用液體深層發酵培養的方法制備蟲草菌絲體，方法見參考文獻［1，2］。將發酵產物減壓抽濾，合并固體部分(菌絲體)并置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重，收集液體部分(胞外發酵液)4℃低溫儲存。

胞內菌絲體部分:采用超聲水提取法。將干燥的菌絲體粉碎(60 目)，精確稱取0.5 g 并加入10 mL 超純水，超聲粉碎0.5 h，提取液5000 rpm 離心15 min，收集上清液，重復提取一次。合并上清液并用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，過濾后濾液用超純水定容至25 mL 容量瓶中，4 ℃冰箱儲存備用。

胞外發酵液部分:將發酵液5000 rpm 離心10 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，過濾后濾液用超純水定容至25 mL 容量瓶中，4 ℃冰箱儲存備用。胞內與胞外部分的每份樣品均平行測定3個樣本。

圖1 混合標準品與三種蟲草樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards and three cordyceps

1.4 色譜條件

應用Shimadzu-ODS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，色譜柱前應用Shimadzu C18保護小柱;流動相:水(A)-甲醇(B)，采用梯度洗脫，0～6.5 min，8%B;6.5～7.5 min，8%～12%B;7.5～8 min，12%～35%B;8.0～15.0 min，35%B;15.0～15.03 min，35%～8%B;使用柱前超聲脫氣，流動相中的每一組分均用0.22 μm 微孔濾膜過濾，配制流動相用Milli-Q 超純水;應用二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長:λ=254 nm，掃描范圍(λ=190～500 nm);柱溫箱溫度:40 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL。在此條件下，五種核苷類化合物分離良好且峰形較好。計算柱效，得到色譜參數理論塔板數大于2000?；旌蠘藴势返纳V圖見圖1-a。

1.5 HPLC-DAD 方法學考察

1.5.1 標準曲線

采用外標法。精確稱取各標準品1 mg，超純水定容至10 mL，制成混合標準品，濃度為0.1 mg/mL的標準對照液，分別取各對照液0.05 到2.5 mL 至5 mL 容量瓶中并定容，逐級稀釋至濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL 的標準溶液，即每一組分分別配制6個濃度，其范圍在1.0-100 μg/mL。分別進樣20 μL 進行測定，并建立峰面積與組分濃度的回歸方程，確定r 值，評估線性關系，確定線性范圍、檢測限和定量限。檢測限和定量限的計算根據藥典以信噪比的方法確定，即分別以基線噪聲的3 倍和10 倍表示二者的值［7］。具體參見表格1。

表1 五種核苷化合物的標準曲線方程及檢測限和定量限Table 1 Regression equation，limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)of 5 nucleosides

1.5.2 選擇性和峰純度

根據每一個標準品的保留時間RT 和%RSD、最大吸收峰的光密度值γ，以色譜-光譜-時間三維立體圖確定每一種待檢測的物質，確定了以保留時間和光密度值雙指標作為定性依據的可行性。利用二極管陣列檢測器計算每一個目標峰的純度指數。

1.5.3 精密度

對色譜系統的性能進行考察。取混合對照品溶液連續進樣5 次，記錄色譜圖，計算峰面積，計算精密度。

1.5.4 穩定性

選擇戴氏蟲草菌絲體作為檢測對象，考察樣品在36 h 內各有效成分的穩定性。將樣品提取液在避光及4 ℃條件下儲存，在36 h 內即第0、4、8、12、24、36 h 分6 次進樣測定，考察峰面積的變化。

1.5.5 重現性

按預定提取方法平行提取樣品江西蟲草菌絲體5份，制備供試液，并進樣檢測，計算平均值和%RSD。

1.5.6 加標回收率

檢查提取方法與色譜條件的可靠性。取戴氏蟲草菌絲體的樣品3 份，分別按照樣品中各個成分的含量加入一定比例(80%、100%、120%)的混合標準品(尿苷、鳥苷和腺苷)，按照前述方法重新提取并進樣檢測，計算回收率。

1.6 供試品測定

將四個樣品(三種蟲草的菌絲體和戴氏蟲草的胞外發酵液部分)分別按照前述2.4 項所述色譜條件進行測定，并計算其中核苷類化合物的含量。

2 實驗結果

2.1 方法學考察結果

2.1.1 選擇性和峰純度

每一個標準品的保留時間RT 和%RSD 分別為尿苷(5.52 ±0.05，0.91%)、肌苷(8.21 ±0.09，1.18%)、鳥苷(8.95 ±0.10，1.19%)、腺苷(14.20±0.12，0.87%)、蟲草素(14.56 ±0.08，0.61%);其最大吸收峰的波長γ 分別為262、249、253、259、260 nm。各檢測峰在其保留時間范圍內沒有受到明顯干擾，有較高的專屬性。每一個檢測目標峰純度指數均大于92%。

2.1.2 精密度

計算得到的每一個標準品的峰面積的%RSD分別為1.89%、2.46%、2.00%、0.98%、1.48%，說明該色譜系統在本次操作條件下有良好的精密度。

2.1.3 穩定性

本次實驗未能檢測到蟲草素，其中尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷四種檢測目標峰面積的% RSD 分別為3.078%，5.0%，1.606%，4.300%，說明各有效成分在36 小時之內穩定。

2.1.4 重現性

計算平均值和%RSD 分別為尿苷(3.15 ±0.53 mg/g，4.04%)、鳥苷(0.11 ±0.02 mg/g，2.84%)、腺苷(1.60 ±0.41 mg/g，2.44%)，證明此方法重現性良好。

2.1.5 加標回收率

尿苷、鳥苷、腺苷三個檢測指標的回收率分別為尿苷(92.04 ±1.91 %)、鳥苷(95.67 ±1.04 %)、腺苷(90.13 ±2.12%)，這表明了該方法所建立的提取方法和色譜條件的可靠性比較好。

2.2 樣品中的含量

結果見表格2，以戴氏蟲草菌絲體和胞外發酵液比較，可見胞外部分未檢測到肌苷，且其中尿苷、鳥苷和腺苷的含量均低于菌絲體部分超過10 倍的數量。其中腺苷存在于每一個樣品中，戴氏蟲草胞外發酵液部分、古尼蟲草菌絲體與野生冬蟲夏草比較其含量相當，而戴氏蟲草和江西蟲草菌絲體與野生冬蟲夏草比較其中含量均比較高［8］。本次實驗在四個樣品中均未能檢測到蟲草菌素。戴氏(胞外與菌絲體)、古尼江西、蟲草四個樣品的HPLC 色譜圖見圖1b～e。

表2 各樣品中核苷類化合物的種類及其含量Table 2 The sorts and contents of nucleosides in the samples

3 討論

本實驗主要考察了江西、戴氏、古尼三種蟲草菌絲體和發酵液中五種核苷類化合物的含量，建立了核苷類化合物的定量檢測方法，從精密度、重現性等實驗結果看這一方法是可靠的。應用HPLC-DAD的檢測方法，采用保留時間和吸光光譜兩個指標，建立色譜-光譜雙指標法有利于準確測量，優于單波長的紫外檢測方法［4，8］。另外，整個檢測過程僅用15 分鐘就全部完成，采用梯度洗脫的方法即可實現五種核苷類化合物的完全分離，而未使用緩沖鹽，這樣減少了維護成本，保護了色譜柱和整個系統。

從測定結果看，胞外發酵液部分也含有一定量的核苷類化合物，雖然含量較低，但仍可以作為進一步開發的對象，如功能性食品或保健飲料等，在野外訓練和軍事保健中具有極大的潛在應用價值;核苷類化合物在菌絲體中的種類不是很全，但含量比較高，如腺苷的含量與野生冬蟲夏草相比較高出10 倍左右［8］，并且均在藥物化學實驗中獲得分離純化［9］，相關實驗表明這些化合物不排除與抗氧化等活性相關［10，11］。從核苷類化合物的種類和含量來看，這種發酵菌絲體作為冬蟲夏草替代品是可行的。下一步可結合分離純化和藥理學實驗進一步完善其質控指標，以期建立系統的品質評價體系和質量控制標準，為今后有目的的開發研究打下基礎。

1 Xiao JH，Chen DX，Liu JW，et al.Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109.J Appl Microb，2004，96:1105-1116.

2 Xiao JH，Chen DX，Wan WH，et al.Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions.Process Biochem，2006，41:1887-1893.

3 Xiao JH，Zhong JJ.Secondary metabolites from Cordyceps species and their antitumor activity studies.Recent Pat Biotechnol，2007，1:123-137.

4 Govindarajan R，Singh DP，Rawat AKS.High-performance liquid chromatographic method for the quantification of phenolics in‘Chyavanprash’a potent Ayurvedic drug.J Pharm Biomed Anal，2007，43:527-532.

5 Liang ZQ(梁宗琦)，Liu AY(劉愛英)，Liu ZY(劉作易).Flora Fungorum Sinicorum.Vol 32，Cordyceps(中國真菌志.第32 卷，蟲草屬).Beijing:Science Press，2007.31-52.

6 Quan guo Zhong Cao Yao Hui Bian(Edition 1).BeiJing:People’s Medical Publishing House，1975.132.

7 Chinese Pharmocopoeia Commission(國家藥典委員會).Chinese Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Mecical Science Press，2005.Vol I，145.

8 Liang HH(梁洪卉)，Cheng Z(程舟)，Yang XL(楊曉伶)，et al.Quantitative determination of nucleosides in Cordyceps sinensis by High-performance liquid chromatographic Method.J Chin Med Mater(中藥材)，2008，31:58-60.

9 Sun ZH(孫忠華)，Xiao JH(肖建輝)，Pan WD(潘衛東)，et al.Study on the chemical constitutes of submerged cultivation mycelium of Cordyceps jiangxiensis.J Chin Med Mater(中藥材)，2010，33:1878-1881.

10 Xiao JH，Xiao DM，Sun ZH，et al.Antioxidative potential of polysaccharide fractions produced from traditional Chinese medicinal macrofungus Cordyceps jiangxiensisin vitro.Afr J Biotechnol，2010，10:6607-6615.

11 Xiao DM(肖代敏)，Xiao JH(肖建輝)，ZHang ZM(張志敏)，et al.Antimicrobial potential of Metarhizium taii in vitro.J Chin Med Mater(中藥材)，2010，33:117-122.