通平養心方對高糖誘導H9c2 心肌細胞損傷的保護作用機制研究

尹 敬，田 煒，魏建強，喇孝瑾，楊雨旸，李繼安*

1河北聯合大學 國家老年醫學國際合作基地;2 唐山工人醫院，唐山 063000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要并發癥之一，隨著糖尿病患病率逐年增加及病程的延續，糖尿病心肌病的發病率也迅速上升。糖尿病心肌病主要以心功能降低，心肌肥大為主要表現，長期發展還可以導致心肌纖維化和心力衰竭。雖然其發病機制尚未完全明了，但是高血糖及其高血糖通過活性氧簇誘導氧化應激在DCM 發病機制中的作用一直是人們關注的熱點［1］。在高糖及氧化應激引起的心肌損害中，線粒體功能障礙是其主要表現形式［2］。因此，通過心肌線粒體功能評價來篩選心肌保護中藥是當今的重要研究途徑。我們以高糖培養建立H9c2 心肌細胞損傷模型，以臨床經驗方通平養心方作為對模型細胞干預因素，觀察其對高糖導致心肌細胞損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗藥品

通平養心方(由瓜蔞、紅景天、葛根、黃芪、丹參、桂枝、薤白、麥冬、赤芍、甘草、蘇子、萊菔子組成):所有中藥飲片均購于唐山市北京同仁堂藥店，由河北聯合大學中醫學院實驗室進行藥物制備。

制備方法:將上述藥物按組方比例混合，研粗末裝于4 層紗布袋封口并置于燒杯中，加10 倍量水浸泡1 h，用文火煎煮2 h，過濾藥液;藥渣再加8 倍量水煮沸1 h，過濾藥液，將2 次濾液合并，濃縮成濃度為1 g/mL 的藥液，4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 細胞株

大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2 細胞株，購自中科院上海細胞庫。

1.1.3 主要材料與試劑

MTT 細胞增殖及毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，DMEM 培養基購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司(批號:NXM0765)?？贵wp-JNK、GAPDH、SP600125 等均購自Cell Signaling technology Inc(CST)。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(批號:A0208);辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(批號:A0216);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.1.4 儀器

37 ℃二氧化碳孵箱(美國ThermoForma 公司)，FV1000 激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，生物安全柜(海爾集團有限公司)，5804R 高速冷凍離心機(德國eppendorf 公司)，JY200C 電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，酶標儀以及半干轉運系統(均來自BIO-RAD 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

H9c2 細胞在37 ℃、5% CO2條件下，以10%FBS 低糖(5.5 mmol/L)DMEM 培養基培養，待細胞生長融合至80%時進行傳代，并取4～6 代細胞進行實驗。實驗時用無血清低糖DMEM 培養細胞48 h，使各組細胞生長同步化后夠進行實驗。

1.2.2 激光共聚焦檢測線粒體膜電位的變化

于超凈臺內，將生長到80%～90%融合狀態的細胞用胰酶消化下來并離心，棄上清后用培養基重懸，混勻，每個共聚焦小皿中加入2 mL 細胞懸液，標記后置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度孵箱培養48 h后;棄去小皿中的培養基，PBS 沖洗2 遍，每個小皿加入新培養基2 mL，并加入線粒體膜電位的特異性標記物TMRE(100 nM)2 μL，37 ℃孵箱孵育20 min后將小皿置于共聚焦顯微鏡觀測臺，隨機選取視野觀察，用波長為543 nm 氦氖激光激發TMRE 熒光染料產生紅色熒光。

實驗分組及處理方法:①Control 組，即高糖組(High Glucose，HG)，小皿置于共聚焦顯微鏡觀測臺后選定視野并掃描圖像，隨后加入33 mmol/L 高糖培養基［3，4］，觀察時間為20 min，掃描圖像。②通平養心方處理組(TP):在小皿進行換培養液后將小皿置于共聚焦顯微鏡觀測臺后選定視野并掃描圖像，然后加入不同終濃度的(10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL)通平養心方進行圖像掃描，于10 min 后對同視野進行圖像掃描，隨后加入高糖培養基觀察時間為20 min，掃描圖像。③SP600125 處理組(SP):小皿換液后選定視野并掃圖，加入10 μM 的JNK 抑制劑SP600125 后進行圖像掃描，于10 min 后對同視野進行圖像掃描，隨后加入高糖培養基觀察時間為20 min，掃描圖像。

1.2.3 MTT 法檢測細胞活力

選擇對數生長期的細胞，胰酶消化后重懸細胞，進行細胞計數，使得96 孔板每孔加入100 μL 約2000個細胞。按照實驗分組處理細胞，在細胞貼壁生長48 h 后，每孔重新換培養基100 μL 后加入10 μL MTT 溶液，在細胞培養箱內繼續孵育4 h。隨后每孔再加入150 μL DMSO，在細胞培養箱內繼續孵育15 min 左右，直至在普通光學顯微鏡下觀察發現藍紫色結晶物全部溶解后，酶標儀570 nm 波長處測定吸光度。

實驗分組:①Control 組，低糖(5.5mmol/L)組;②HG 組，高糖(33mmol/L)組;③TP +HG 組，通平養心方(0.1 μg/mL)預處理10 min，再加入高糖培養基20 min;④TP 組，通平養心方(0.1 μg/mL)預處理10 min，再加入低糖培養基20 min。

1.2.4 Western Blot 檢測p-JNK、p-GSK-3β 水平

收集各組細胞，加入裂解液于冰上裂解30 min，刮取細胞，4 ℃、12000 rpm 離心15 min。將上清移至1 mL Ep 管中。用BCA 蛋白定量試劑盒制備標準曲線，酶標儀測定562 nm 波長下蛋白的吸光度。制備10%分離膠和5%濃縮膠，將蛋白與2 ×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min 使蛋白變性。上樣總蛋白為60 μg，加入電泳緩沖液，80 V 電泳約40 min，待進入分離膠后改為150 V 約1 h。再以52 mA，轉PVDF 膜2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入相應一抗(p-JNK 1 ∶1000，p-GSK-3β 1 ∶1000，GAPDH 1∶500)，4 ℃過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶1000)，山羊抗小鼠IgG(1∶1000)，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL 顯色，暗室內曝光。結果用ImageJ 軟件分析，計算條帶的吸光度值，采用目的蛋白與內參的比值來表示蛋白表達水平。

實驗分組:①Control 組，加入低糖(5.5 mmol/L)培養基20 min;②HG 組，加入高糖(33 mmol/L)培養基20 min;③TP +HG 組，通平養心方預(0.1 μg/mL)處理10 min，再加入高糖培養基20 min;④TP組，通平養心方預(0.1 μg/mL)處理10 min，再加入低糖培養基20 min;⑤SP 組，JNK 抑制劑預處理組10 min，再加入低糖培養基20 min;⑥SP+HG 組，JNK 抑制劑預處理10 min，再加入高糖培養基20 min。

1.3 數據處理

實驗所得數據均以Excel 表建立數據庫，數據均采用均數±標準差()表示。應用SPSS13.0統計軟件對數據進行t 檢驗、方差分析，統計學檢驗以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 不同處理組細胞TMRE 熒光強度的影響

33mmol/L 葡萄糖(HG)處理H9c2 細胞20 min后，TMRE 熒光強度明顯減弱(降至45.1 ±2.8 %，P＜0.05)，提示此濃度的葡萄糖可以引起線粒體損傷，從而引起mPTP 的開放。與高糖組相比，用JNK抑制劑SP600125(10μM)及不同濃度(10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL)通平養心方預處理，各組均使高糖引起的TMRE 熒光減弱程度下降(P＜0.05)，其中0.1 μg/mL TP 組的抑制作用最為顯著(90.1± 3.7%，P＜0.05)，與JNK 抑制劑作用類似，提示TP 可以抑制高糖引起的線粒體損傷，并且這種保護作用以0.1 μg/mL 組最為顯著(表1，圖1)。

表1 不同處理組TMRE 熒光強度變化(n=7，)Table 1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups(n=7，)

表1 不同處理組TMRE 熒光強度變化(n=7，)Table 1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups(n=7，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05.

2.2 通平養心方降低高糖引起的心肌細胞毒性

與Control 組(低糖5.5 mmol/L)相比，0.1 μg/mL TP 預處理能顯著對抗HG 對H9c2 心肌細胞的毒性作用，使細胞存活率從73.0 ±2.0%增加至89.3 ±3.5%(P＜0.05;表2)。

表2 不同處理組對細胞活性的影響(n=20，)Table 2 Effects of different treatment groups on cell viability(n=20，)

表2 不同處理組對細胞活性的影響(n=20，)Table 2 Effects of different treatment groups on cell viability(n=20，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05，#P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05，#P＜0.05.

圖1 激光共聚焦顯微鏡成像顯示不同處理組TMRE 熒光強度(×400)Fig.1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups detected by LSCM(×400)

2.3 通平養心方對JNK 通路的影響

Western blot 結果顯示(表3，圖2)，與Control組(低糖5.5 mmol/L)相比，HG 能夠引起p-JNK 的表達明顯增高(198.6 ±22.0%，P＜0.05)，0.1 μg/mL TP 預處理后使高糖引起的p-JNK 的表達增高被抑制(113.5 ±7.9%，P＜0.05)。在加入JNK 抑制劑SP600125 預處理后，同樣使得高糖引起的p-JNK的表達增高被抑制(129.7 ±7.8%，P＜0.05)，說明通平養心方與JNK 抑制劑SP600125 的作用相似，提示通平養心方可通過下調p-JNK 的表達發揮抗心肌氧化損傷作用。

2.4 通平養心方對GSK-3β 磷酸化的影響

Western blot 結果顯示(表4，圖3)，與對照組相比，高糖能夠引起p-GSK-3β(Ser9)表達明顯降低，提示高糖引起的氧化應激通過抑制GSK-3β 磷酸化，促進mPTP 孔的開放。單獨通平養心方處理組與HG 組相比，p-GSK-3β 的表達增高(130.9 ±7.3%，P＜0.05)，提示通平養心方可以促進GSK-3β 磷酸化。與HG 組相比，0.1 μg/mL TP +HG 處理組p-GSK-3β 表達增加(89.9 ±10.9%，P＜0.05)，而這種增加作用，與JNK 抑制劑SP600125 類似，說明在高糖引起的心肌損傷時，通平養心方可能是通過降低JNK 的活性，使p-GSK-3β 表達增加，抑制mPTP的開放，從而對心肌細胞發揮保護作用。

表3 p-JNK 蛋白的表達(n=6，)Table 3 The optical density of the expression of p-JNK(n=6，)

表3 p-JNK 蛋白的表達(n=6，)Table 3 The optical density of the expression of p-JNK(n=6，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;與高糖(HG 組)比較，#P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05;Compare with high glucose，#P＜0.05.

圖2 p-JNK 蛋白的表達Fig.2 The optical density of the expression of p-JNK

表4 p-GSK-3β 蛋白的表達(n=6，)Table 4 The optical density of the expression of p-GSK-3β(n=6，)

表4 p-GSK-3β 蛋白的表達(n=6，)Table 4 The optical density of the expression of p-GSK-3β(n=6，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;與高糖(HG 組)比較，#P＜0.05;與高糖+通平組相比，△P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05;Compare with high glucose，#P＜0.05;Compare with high glucose and TP，△P＜0.05.

圖3 p-Gsk-3β 蛋白的表達Fig.3 The optical density of the expression of p-Gsk-3β

3 討論

糖尿病心肌病發病機制非常復雜，其中高血糖作為心肌損害的獨立危險因素能造成心肌氧化代謝異常［5］，持續的高糖狀態使心肌細胞處于過度氧化應激狀態，而過度的氧化應激可激活多條促凋亡信號通路［6］。其中JNK 通路可能參與了高糖誘導H9c2 細胞的凋亡過程。GSK-3β 作為JNK 通路下游因子，是調控心肌細胞mPTP 開放的關鍵，而mPTP對維持線粒體的正常結構和功能至關重要，應激條件下mPTP 開放會導致線粒體腫脹，膜電位消失，這是引起心肌損傷的重要環節［7］。許多心肌保護藥物是通過抑制GSK-3β 的活性來阻止mPTP 開放，從而在心肌缺血/再灌注損傷中發揮保護作用的［8，9］。因此，JNK 通路可能也是高糖所致心肌損害的重要途徑，由此推測，JNK 通路可能是治療糖尿病心肌病的新靶點。

通過參考Cai 等［3］和Li 等［4］的相關研究，本研究主要采用33 mmol/L 作為高糖誘導心肌細胞損傷的條件。結果發現，在33 mmol/L 高糖處理條件下，H9c2 細胞TMRE 熒光強度明顯減弱，細胞存活率明顯降低，p-JNK 蛋白表達增加，GSK-3β 磷酸化水平顯著降低。而這一作用被JNK 的抑制劑SP600125拮抗，進一步證明JNK 通路參與了高糖誘導的心肌細胞損傷(表3，圖2)。由此提示，高濃度的葡萄糖對心肌細胞的損害是通過JNK-GSK-3β-mPTP 途徑實現的。

通平養心方由《金匱要略》瓜蔞薤白白酒湯合三子養親湯化裁而來，全方合用通陽散結，祛痰下氣，活血通脈。臨床觀察對糖尿病心肌病有良好治療作用。方中主要藥物瓜蔞有保護缺血心肌，縮小梗死范圍的作用。另外，我們研究發現，方中其他主要藥物，如紅景天的主要成分紅景天苷可抑制心肌細胞mPTP 的開放發揮保護心肌作用［10］、葛根的主要成分葛根素對糖尿病大鼠心肌有保護作用［11］。由此推測通平養心方防治糖尿病心肌病作用的機制之一是通過心肌保護實現的。

研究結果提示，通平養心方預處理能保護高糖引起的心肌細胞損傷，抑制p-JNK 蛋白表達，提高GSK-3β 磷酸化水平，能夠抑制mPTP 開放，減輕高糖應激對心肌細胞線粒體的損傷(表1，圖1)，增加細胞存活率(表2)。其中0.1 μg/mL 濃度的通平養心方最佳，其與JNK 的抑制劑SP600125 作用相似。

綜上所述，通平養心方對高糖誘導的H9c2 細胞損傷具有一定的保護作用，其作用機制之一可能是通過JNK 通路，抑制p-JNK 蛋白表達、促進GSK-3β 的磷酸化、從而抑制mPTP 的開放實現的。

1 Li QF(李慶鳳)，Su K(蘇珂).The research progress of the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy.Chin General Prac(中華全科醫學)，2011，9:291-311.

2 Xiong Y(熊燕)，Zhang M(張梅)，Chen F(陳菲)，et al.Mitochondrial dysfunction and cardiovascular disease.Chin J Pathophysi(中國病理生理雜志)，2013，29:364-370.

3 Cai L，Li W，Wang GW，et al.Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium mitochondrial cytochrome c-mediated caspase-3 activation pathway.Diabetes，2002，6:1938-1948.

4 Li Y，Li Y，Feng Q，et al.Calpain activation contributes to hyperglycaemia-induced apoptosis in cardiomyocytes.Cardiovasc Res，2009，84:100-110.

5 Liang JL(梁家亮)，Yu XY(余細勇)，Shan ZX(單志新)，et al.The research of H9c2 cardiomyocytes apoptosis and activate JNK pathway induced by high glucose.J Prac Med J(實用醫學雜志)，2010，26:2094-2097.

6 Trachootham D，Lu W，Ogasawara MA，et al.Redox regulation of cell survival.Antioxid Redox Signal，2008，10:1343-1347.

7 Zhang M(張夢)，Hu YX(胡亦新)，Cui H(崔華).Resveratrol by raising the silent information adjustment factor 1 adjustment cigarettes extract induced myocardial mitochondria produce reactive oxygen species.Chin J Health Care Med(中華保健醫學雜志)，2013，15:163-172.

8 Xu J，Tian W，Ma X，et al.The molecular mechanism underlying morphine-induced akt activation:roles of protein phosphatases and reactive oxygen species.Cell Biochem Biophys，2011，61:303-311.

9 Song YO，Wang L，Poyil P，et al.Cadmium induces carcinogenesis in BEAS-2B cells through ROS-dependent activation of PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin signaling.Toxicol Appl Pharmacol，2012，264:153-160.

10 Li T(李婷)，Zhang Y(張瑩)，Li L(李琳).Salidroside inhibition mechanism of myocardial cell apoptosis induced by hypoxia experiment research.Space Med Med Engineer(航天醫學與醫學工程)，2011，24:21-24.

11 Chen XF(陳秀芳)，Lei KF(雷康福)，Dong M(董敏)，et al.Effect of puerarin on myocardial damage in STZ induced diabeticrats.Chin J Pathophysi(中國病理生理雜志)，2010，26:650-655.