烏骨雞黑色素氧化降解工藝研究

黃宇玫，田穎剛，喬娟娟

1南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047;2 南昌大學 科學技術學院，南昌 330029

烏骨雞黑色素是一種大分子的生物功能活性物質，具有抗氧化清除自由基［1］、延緩衰老［2］、抗誘變和提高機體免疫力［3］等功能，由于烏骨雞黑色素具有黑色素的共性特征，即不溶于水和幾乎所有溶劑且與蛋白質緊密相連［4］，這對烏骨雞黑色素的深入研究造成極大的影響。目前國內外大多對烏骨雞黑色素這一系多聚物進行整體性研究，通過元素分析、ICP-AES 對其C、H、O、N、S 及金屬元素進行分析，通過波譜法(紅外光譜、電子能譜、電子順磁共振波譜、X-射線衍生等)研究其基本結構特征。但這些結構特征及信息仍不能完全闡述烏骨雞黑色素的結構。

近年來，研究者采用化學氧化降解法［5］、高溫裂解氣相質譜法［6］對烏骨雞黑色素進行裂解，并對裂解后物質進行相關研究，期望對烏骨雞黑色素結構進行進一步闡明，其中化學氧化降解法包括高錳酸鉀氧化降解法、堿性過氧化氫氧化降解法。孫亞真等［7］對烏骨雞黑色素進行化學氧化降解，并用HPLC 色譜對降解產物酸性乙醚萃取物進行分析發現降解產物中PDCA 和PTCA;涂勇剛等采用Py-GC/MS 對烏骨雞黑色素進行高溫裂解分析發現裂解產物中存在苯、苯酚、吲哚、吡咯、氰類衍生物及脂類物質。

烏骨雞黑色素作為一個大分子多聚物，實驗室前期研究發現，經過化學降解所得降解產物較復雜，且不同的降解方法對烏骨雞黑色素的降解程度及降解產物的種類是有影響的。本實驗采用四種不同的氧化降解方法對烏骨雞黑色素進行降解，并對降解得率、降解產物分子量進行初步分析，運用GC-MS對不同降解方法所得降解產物乙醚萃取部分進行分析，為指示不同降解方法對烏骨雞黑色素降解程度及降解產物中物質的種類的影響，也為進一步研究烏骨雞黑色素結構及彼此間生源關系提供一定的依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

烏骨雞黑色素由實驗室自制。

硅膠G 板，青島海洋化工廠分廠;牛血清白蛋白，上海麗珠東風生物技術有限公司;細胞色素C、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸，購于索萊寶公司;葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、濃硫酸、高錳酸鉀、亞硫酸鈉、碳酸鉀、過氧化氫(30%)、氫氧化鈉、氨水(25%)、乙醚、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、香草醛、硫酸、磷酸、氯化鐵、溴酚蘭、溴百里酚蘭、磷鉬酸、茚三酮、正丁醇、對二甲氨基苯甲醛、丙酮、硅鎢酸等，均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;HL-2S 恒流泵，上海青浦滬西儀器廠;旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;G1314B 型Agilent 紫外檢測器;G1310A 型Agilent 單元泵;Agilent 6890 型氣相色譜與5973 型質譜聯用儀;ZF-2型三相紫外儀，上海安亭電子儀器廠;TGL-16G-A離心機，上海安亭科學儀器廠;Precisa XB220A 分析天平;HH-4 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;PHS-2C 型pH 計，上海理達儀器廠;UV-2000 紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司;DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 烏骨雞黑色素的不同方法降解

2.1.1 碳酸鉀-過氧化氫氧化法

［8］并做改進，精密稱取100 mg 烏骨雞黑色素，加入100 mL 1 mol/L K2CO3，以一定流速連續通入4 mL 30% H2O2(可稀釋處理)，100 ℃加熱回流反應。反應結束后流水冷卻，取1/4 反應液離心(6000 rpm，5 min)，沉淀用蒸餾水洗滌兩次后，合并上清，上清與沉淀置于恒重后坩堝中，于105 ℃恒重，以計算降解得率。剩余反應液用重蒸后乙醚進行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產物中揮發性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于降解產物成分及分子量分析。樣品編號為A。

2.1.2 高錳酸鉀氧化法

參考文獻［9］并做改進，精密稱取100 mg 烏骨雞黑色素，置于500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 1 mol/L H2SO4，混勻后，加入3% KMnO4，每次200 μL，高速磁力攪拌反應至紫色消失時，立即再次加入200 μL，直到紫色不消失，靜置10 min 后，加入10% Na2SO32 mL 除去剩余的KMnO4和MnO2。取1/4 反應液離心(6000 rpm，5 min)用于得率分析，剩余反應液用重蒸后乙醚進行萃取，每次5 mL，萃取5次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產物中揮發性成分)分析;萃取后剩余水相縮后定容到50 mL 用于降解產物成分及分子量分析，樣品編號為B。

2.1.3 氫氧化鈉-過氧化氫氧化法

精密稱取烏骨雞黑色素100 mg，置于50mL 反應釜內，加入pH 12 的NaOH 溶液20 mL，以0.2 mL/min 流速通入30%的H2O23.4 mL(可稀釋處理)，90 ℃保溫攪拌冷凝反應，反應20 h，反應結束后流水冷卻。降解液定重至40 g，取混勻的降解液10 g 用于得率分析，剩余反應液用重蒸后乙醚進行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1mL 用于GC-MS(降解產物中揮發性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于降解產物成分及分子量分析，樣品編號為C。

2.1.4 氨水-過氧化氫氧化法

參考文獻［10］并做進一步改進，精密稱取100 mg烏骨雞黑色素，按固液比10∶3(W∶V)加入pH 值為10 的氨水溶液，勻速通入30%的H2O22.5 mL(可稀釋處理)，70 ℃水浴攪拌反應8 h，流水冷卻后，定重，反應液混勻后取1/4 用于得率分析，剩余反應液用重蒸后乙醚進行萃取，每次5 mL，萃取5 次，萃取液合并后用無水硫酸鈉除去水分，濃縮至1 mL 用于GC-MS(降解產物中揮發性成分)分析;萃取后剩余液濃縮后定容到50 mL 以用于產物成分及分子量分析，樣品編號為D。

2.1.5 得率計算

2.2 烏骨雞黑色素降解產物分子量分布測定

運用凝膠色譜柱測定不同方法降解所得烏骨雞黑色素降解產物的分子量分布，用已知分子量標準品作分子量與時間的標準曲線來衡量各降解產物的分子量分布情況，從而比較不同方法所獲降解產物分子量大小，為后期研究提供依據。前期研究發現烏骨雞黑色素降解產物紫外全波長掃描圖中最大吸收峰在205～215 nm 之前，故本實驗吸光度測定選用210 nm。

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 分子量范圍100～7000 Da

儀器:Agilent131 型高效液相色譜儀;色譜柱:Superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm I.D.，13-15 μm);檢測器:Agilent G1314B 型紫外檢測器;檢測波長:210 nm;流動相:0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，含0.01 mol/L 氯化鈉，pH 為6.96;流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL。

2.2.1.2 分子量范圍＞7000 Da

儀器:Waters515 二元高壓高效液相色譜儀;色譜柱:Ultrahydrogel Linea 7.8 ×300 mm column;檢測器:視差檢測器(RID-10A 型);流動相:超純水;檢測溫度:35 ℃，柱溫箱:35 ℃;流速:0.6 mL/min;進樣量:20 μL。

2.2.2 分子量標準曲線的繪制

分子量范圍100～7000 Da:將分子量標準品用流動相配制成0.5 mg/mL 的溶液，充分溶解混勻后用0.45 μm 水系膜過濾，按“2.2.1.1”色譜條件進樣分析。分子量標準品分別為:細胞色素C、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽以及甘氨酸。

分子量＞7000 Da:將系列分子量標品用超純水配制成2 mg/mL 的溶液，充分溶解后用0.45 μm 水系膜過濾，按“2.2.1.2”色譜條件進行分析，葡聚糖標品分別為:T-2000(2000000 Da)、T-70(7000 Da)、T-40(4000 Da)、T-10(10000 Da)和葡萄糖(180 Da)。

2.2.3 不同降解產物的分子量測定

將A、B、C 樣用流動相配制成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，0.45 μm 的水系微孔濾膜過濾，按“2.2.1.1”色譜條件進樣分析;D 樣配制為用超純水4 mg/mL 溶液，按“2.2.1.2”色譜條件進行分析。

2.3 四種不同降解產物乙醚萃取物GC-MS 初步分析

2.3.1 GC-MS 分析條件

色譜條件:Agilent HP-5 毛細管色譜柱(30 m ×250 μm，0.25 μm);自動進樣，進樣量1 μL，不分流模式，進樣口溫度250 ℃;程序升溫:初始溫度60℃，保留3 min，以5 ℃/min 的速率升至300 ℃，保留15 min;檢測器溫度250 ℃;載氣He，流速1 mL/min。

質譜條件:EI 電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;掃描周期2.84 次/s，掃描范圍33～500 u;數據處理系統MSD Chem Station;標準質譜譜庫:NIST02。

2.3.2 樣品分析

取“2.1”所制備乙醚萃取物過膜進行GC-MS 分析。

3 結果與討論

3.1 四種不同氧化降解方法對烏骨雞黑色素可溶性產物得率的影響

由圖1 可看出，在高錳酸鉀條件下，降解產物得率最高，達到82.5%;碳酸鉀-過氧化氫降解得率次之，為61.5%;氫氧化鈉-過氧化氫(pH 12)及氨水-過氧化氫(pH 10)得率分別為56%和53.6%，這表明在強堿及強氧化條件下，烏骨雞黑色素降解產物得率較中低強度堿性條件下要高，推測可能由于強堿條件下黑色素舒展溶解性增強，更易被過氧化氫氧化斷裂所致。

圖1 不同降解方法所得可溶性產物得率Fig.1 Yields of soluble components of BSFM degradation products using different degradation methods

但由于強酸強堿條件，降解產物中酸及鹽的含量較高，使后期水溶性降解產物的分離程序變復雜，且對水溶性降解產物分析也造成了較大的影響;與其相比，較弱的條件降解得率可達到50%以上，且雜質含量少，分析水溶性產物較便利。

3.2 四種不同氧化降解方法對烏骨雞黑色素水溶性產物分子量的影響

3.2.1 分子量標準曲線的制作

3.2.1.1 分子量范圍100-7000 Da 標準曲線

表1 為甘氨酸、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽和細胞色素C 在凝膠柱上的保留時間，根據此表得出分子量標準曲線方程為:logMw=-0.2272x +7.1626，R2=0.9957。

表1 分子量標準品保留時間min 及logMwTable 1 The retention times and logarithmic values of molecular weight markers

3.2.1.2 分子量＞7000 Da 標準曲線

運用凝膠色譜測定物質分子量的依據是凝膠的分子篩原理，即對于某一型號的凝膠，其要求的分子量范圍內，物質分子量的對數(LogMw)與其在凝膠柱上的洗脫體積(Ve)及分配系數(Kav)存在線性關系，根據關系式Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)，Ve=abLogMw(其中V0為藍色葡聚糖的洗脫體積，Vt 為葡萄糖的洗脫體積)計算出Ve 和Kav，以LogMw 為橫坐標，Kav 為縱坐標做標準曲線，分子量標準曲線方程為 Kav=-0.2383LogMw+1.5498，R2=0.9909。

表2 系列葡聚糖的保留體積Ve 和KavTable 2 The retention volume and Kav of Dextrans

對四種不同降解產物水溶性部分的分子量分布進行初步測定，降解產物分子量分布不僅可以間接評估降解方法的劇烈程度，同時也對烏骨雞黑色素在不同方法下的降解程度進行了指示。通過對降解程度不同的掌握，為降解產物進一步的分析做了基礎鋪墊。水溶性產物分子量分布結果如圖2，烏骨雞黑色素各方法降解產物分子量如表3 所示。氨水-過氧化氫降解分子量最大，且分子量跨度也較大為一千到幾萬道爾頓，次之為碳酸鉀-過氧化氫降解，氫氧化鈉-過氧化氫與高錳酸鉀降解樣圖譜保留時間相當，分子量相當，均在1000 Da 以下，這表明不同降解方法對烏骨雞黑色素的降解程度不同，其中強酸性環境下高錳酸鉀氧化降解烏骨雞黑色素程度最大，而氨水-過氧化氫的降解程度最小，進一步表明強酸、強堿介質中黑色素更容易被氧化斷裂。

表3 烏骨雞黑色素各方法降解產物分子量Table 3 The molecular weight distribution of different degradation products

圖2 樣品A、B、C、D 的分子量分布圖Fig.2 The molecular weight distribution of sample A，B，C and D

3.3 GC-MS 分析不同降解產物的乙醚萃取部份的化學組成

烏骨雞黑色素的化學氧化降解過程亦是一個復雜的過程，且產物亦是復雜混合的未知物。采用GC-MS 對四種不同氧化降解方法獲得的降解產物乙醚萃取部分進行物質定性分析。圖3 為四種樣品總離子流圖，由圖可以看出A、B、C 樣乙醚萃取物中物質含量較D 樣多，且A、B 樣物質含量相當;從種類數來看，D 樣物質種類數最少，其他三種樣品相當;從物質成分來看，A 和B 樣中物質主要以有機酸和脂類物質為主，其中A 又以脂類為主，還含有少量萘、醛、酮、醇、菲、唑及胺類物質，B 則以有機酸類物質為主，含有少許烴類及吡喃、呋喃、吡唑衍生物，C 樣中主要成分為脂肪族與不飽和烴類、酮及醛類，還含有少量吡啶、呋喃、吖啶、少量有機酸及醚類物質;D 樣中成分為酚類衍生物、烴類、芴、酰胺以及喹啉衍生物。

四種不同氧化降解樣品乙醚萃取物中的物質種類和含量有差異與降解條件有很大的關系，碳酸鉀降解提供了強堿性環境，為過氧化氫的氧化提供了一個有利的條件;盡管黑色素不溶于酸性介質，但高錳酸鉀在強酸性條件下有極強的氧化能力，故在降解產物中存在許多被徹底氧化的有機酸類物質;氨水-過氧化氫由于對黑色素的斷裂程度最低，降解產物分子量較大，故其萃取物中的物質種類及含量較少。

圖3 樣品A、B、C、D 乙醚萃取物GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of ethereal extracts of BSFM degradation products A，B，C and D

4 結論與討論

烏骨雞黑色素經四種不同化學氧化降解方法降解后，降解產物中產物得率、分子量分布及乙醚萃取物存在的揮發性成分進行分析。結果顯示:降解方法不同，降解產物各指標也存在相應差異。降解產物得率隨降解條件強度的增加而增大，強氧化條件下得率較中低強度堿性條件下要高，其中高錳酸鉀法最高為82.5%，碳酸鉀-過氧化氫次之為61.5%，其余均在50%以上;降解產物分子量以氨水-過氧化氫法最高，高達12265.5 Da，碳酸鉀-過氧化氫次之為1572.8 Da。

四種降解產物乙醚萃取物揮發性物質分析發現氨水-過氧化氫降解產物中揮發性成分較少，可能與其降解產物程度較小產物、分子量較大有關;其他方法所得產物中揮發性成分均較多，其中氫氧化鈉-過氧化氫降解物中以烴類物質為主，也存在少量的酸類物質，而碳酸鉀和高錳酸鉀降解產物中以脂肪酸和酯類物質為主，含有少量烴類物質。這表明降解方法的不同對影響到降解產物各方面的性質差異。烏骨雞黑色素是大分子生物多聚物，其降解過程較復雜且存在各種不確定性，故控制好降解條件對其結構成分的研究有一定的幫助，通過初步確定化合物種類亦可為后期相應產物分離奠定基礎。

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