小球藻對海水沖廁污水的凈化作用及其產油性能研究

邱金泉，成 玉，張曉青，王 靜，張雨山

（國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192）

海水利用是解決沿海城市淡水供求矛盾的有效途徑，采用海水沖廁可以節省30%的城市生活用水，社會效益和經濟效益非常顯著［1］。隨著海水沖廁技術的逐步推廣和應用，如何對海水沖廁后所產生的含鹽污水進行經濟、有效的處理，已成為當前亟待研究的課題。

小球藻（Chlorella vulgaris）作為一種高污染環境耐受性的微藻，由于具有生長快速、氮磷吸收能力強等特點，目前已被廣泛應用于各類污水的處理［2－3］。近年來研究發現，小球藻體內富含相當可觀的油脂類物質，可用來提取微藻油制備生物柴油［4］。因此，如能考慮將小球藻的污水處理能力與油脂積累特性進行有機結合，在凈化污水水質的同時，實現清潔燃料的低成本生產，將可謂是一舉多得。

作者以海水沖廁污水作為微藻培養液，考察了小球藻對海水沖廁污水中氮、磷和有機物的去除效果及其自身油脂積累特性，以期為海水沖廁污水的經濟、高效、資源化處理提供可行途徑。

1 實驗

1.1 實驗用水

模擬海水沖廁污水由生活污水和海水按7∶3的比例配制而成，其中生活污水取自市政排污口，海水取自天津塘沽近岸海域，根據實驗需要添加一定濃度的葡萄糖、NH4Cl和KH2PO4，調節污水的CODCr、氨氮和總磷濃度分別為300mg·L－1、25mg·L－1和2.5 mg·L－1左右，再用1mol·L－1的NaOH溶液調pH值至7.5左右，污水的鹽度在11‰左右。使用前煮沸10min滅菌，冷卻。

1.2 藻種

小球藻（Chlorella vulgaris）藻種購自中國科學院水生生物研究所藻種庫。以標準BG11培養液培養至對數生長期后備用。

1.3 方法

1.3.1 小球藻生長曲線的測定

取對數生長末期的小球藻液接種至培養液中，每隔72h取樣，用紫外可見分光光度儀測定藻液在680nm處的吸光值（OD680），以OD680表示藻細胞的生長情況。

1.3.2 小球藻對海水沖廁污水中CODCr、氨氮、總磷的去除

取對數生長末期的小球藻液，以4 000r·min－1離心5min后，棄上清，加入15mg·L－1的NaHCO3溶液離心洗滌2次后，加入適量無菌水配成藻液。接種至裝有200mL污水的500mL三角瓶中，接種藻密度約為106個·mL－1，實驗設置3個平行樣。接種藻液置于25℃、3000lux光照培養箱中培養，光暗比為12h∶12h，每日定時搖瓶3次。分別于開始培養后第3d、6d、9d、12d各取樣15mL，經0.45μm醋酸纖維膜過濾后，測定CODCr、氨氮和總磷。

CODCr測定采用重鉻酸鉀法，氨氮測定采用鈉氏試劑比色法，總磷測定采用鉬銻抗分光光度法。

1.3.3 小球藻油脂的提取

采用改進的氯仿／甲醇法提取油脂［5］。取對數生長末期的小球藻液，離心收集藻細胞（10 000r·min－1，10min），經冷凍干燥后充分研磨成藻粉。稱取100mg干藻粉，加入6mL氯仿－甲醇溶液（1∶2），振蕩提取30min，再加入2mL氯仿、3.6mL水，振蕩混勻后離心（6 000r·min－1，10min），取上清液。重復以上操作3次，將收集到的上清液混勻后離心（6 000r·min－1，5min），靜置5min，取下層氯仿至準確稱量的坩堝中，于60℃水浴中蒸干，然后轉移至60℃烘箱中烘至恒質量，稱量后計算油脂含量。

1.3.4 小球藻脂肪酸組成分析

室溫下將提取的小球藻油脂用氫氧化鉀－甲醇甲酯化后，取所得脂肪酸甲酯進行氣質聯用分析，以確定小球藻中脂肪酸組分及其含量。使用儀器為Bruker 436－GC與SCION SQ MS聯用系統。色譜柱：HP－5MS（30m×0.25mm，0.25μm），進樣量0.5μL，進樣口溫度250℃，載氣He，柱前壓265kPa，分流比10∶1，升溫程序：初始溫度170℃，保持2min，以10℃·min－1程序升溫至200℃，保持32min。

2 結果與討論

2.1 小球藻在海水沖廁污水中的生長狀況（圖1）

圖1 小球藻在不同培養液中的生長曲線Fig.1 Growth curves of C.vulgarisin seawater toilet－flushing sewage and BG11medium

由圖1可以看出：BG11培養液中小球藻在前12d的OD680值一直保持上升，12d時達到1.572；而海水沖廁污水中小球藻的OD680值在第9d時達到最大，為0.797，隨后逐漸下降。與小球藻在BG11培養液中可以維持較高的生長水平相比，海水沖廁污水中小球藻的生長速度明顯較慢，其最大生物量僅為BG11培養液中最大生物量的50%左右。

2.2 小球藻對海水沖廁污水的凈化作用

小球藻對海水沖廁污水中氨氮、總磷和CODCr的去除效果見圖2。

圖2 小球藻對海水沖廁污水中氨氮、總磷和CODCr的去除效果Fig.2 Removal efficiency of NH＋4－N，TP and CODCrfrom seawater toilet－flusing sewage during C.vulgaris cultivation

由圖2可以看出：海水沖廁污水中的氨氮和總磷在培養初期消耗很快，第3d時氨氮濃度由初始的22.6mg·L－1降至7.56mg·L－1，去除率為66.5%，而總磷濃度由初始的2.624mg·L－1降至0.224mg·L－1，去除率達到了91.5%。此后隨培養時間的延長，氨氮和總磷的濃度一直保持下降趨勢，至第12d時，小球藻對海水沖廁污水中氨氮和總磷的去除率分別達到87.9%和98.2%。與氨氮和總磷的去除不同，小球藻對海水沖廁污水中CODCr的凈化作用非常有限，實驗期間CODCr濃度下降比較緩慢，至第12d實驗結束時，CODCr濃度由初始的338.7mg·L－1降至264.8mg·L－1，去除率僅為21.8%。

2.3 不同培養液中小球藻油脂產率比較

分別用BG11培養液和海水沖廁污水培養小球藻，第9d時離心收獲藻體，經冷凍干燥后，測定兩種不同培養液中培養出的小球藻的生物量及干藻粉中總脂含量，結果見圖3。

圖3 不同培養液收獲的干藻生物量和總脂含量Fig.3 Biomass production and total lipid content in different culture media

由圖3可以看出：用BG11培養液培養的小球藻干生物量為0.84g·L－1，細胞總脂含量為28.86%；而用海水沖廁污水培養的小球藻干生物量為0.47g·L－1，細胞總脂含量較高，達到33.03%。進一步計算可知用BG11培養液培養小球藻，每升培養液可收獲微藻油脂0.2419g，而用海水沖廁污水培養小球藻，每升培養液可收獲微藻油脂0.1533g，是BG11收獲量的64.2%。

2.4 不同培養液中小球藻脂肪酸組成分析（表1）

表1 不同培養液中小球藻脂肪酸組成／%Tab.1 The fatty acid compositions of C.vulgarisin different culture media／%

大多數產油微藻的脂肪酸組成與油料植物相似，小球藻也不例外。由表1可以看出，BG11培養液與海水沖廁污水培養的小球藻脂肪酸主要組分有C16：0的軟脂酸、C16：1的棕櫚一烯酸、C18：2的亞油酸以及C18：3的亞麻酸等。與BG11中培養的小球藻相比，海水沖廁污水中培養的小球藻的脂肪酸中亞油酸比例有所上升，此外還檢出了少量C14：0豆蔻酸、C17：0十七烷酸、C18：0硬脂酸、C18：1油酸等組分。總體來看，海水沖廁污水培養的小球藻的脂肪酸以C16和C18為主，符合作為生物柴油生產原料的要求。

2.5 討論

2.5.1 海水沖廁污水中小球藻的生長及其對污染物的凈化

氮、磷作為維持藻類正常生長的必需元素，在小球藻的生長、繁殖等生理過程中起著非常重要的作用。海水沖廁污水中氮、磷的濃度相比BG11培養液要低很多，養分的缺乏使得小球藻的生長速度及生物量都較低，特別是在生長的中后期（6d后），這種差距更為明顯，同時培養液中的磷含量已經降到了很低的水平（圖2b），限制了小球藻的增殖。除氮和磷之外，鹽度也是影響小球藻正常增殖的重要因子，雖然小球藻對鹽度有較強的適應性，但海水沖廁污水的鹽度較高，仍可能會對小球藻的生長產生抑制作用。

小球藻對海水沖廁污水中氨氮和總磷具有較強的吸收凈化能力，去除率分別達到87.9%和98.2%，特別是在培養初期，小球藻細胞能夠從培養液中快速攝取氮磷等營養元素供其快速生長。藻類對有機污染物的代謝過程就是利用有機物作為碳源、能源生長的過程，與氮磷的凈化去除不同，實驗過程中小球藻除可以利用海水沖廁污水中的有機物外，還可以吸收空氣中的CO2作為碳源進行生長和代謝，這可能是小球藻對海水沖廁污水中CODCr凈化效率偏低的主要原因。

2.5.2 海水沖廁污水中小球藻的產油特性

脂肪酸甲酯是生物柴油的主要存在形式，因此，通過測定小球藻的脂肪酸總量及組分，可以評估小球藻用于生產生物柴油的潛力。實驗發現小球藻能夠較好地適應海水沖廁污水環境，并且收獲的藻體內的總脂含量甚至還要高于BG11培養液培養的小球藻。雖然單位體積培養液獲得的油脂質量與采用BG11培養液相比有所降低，但是由于海水沖廁污水作為培養基廉價易得，并且在獲得清潔能源的同時可以解決環境污染問題，如能通過技術優化，提高微藻生長與產油速率，將具有良好的應用前景。

目前關于培養條件對微藻脂肪酸組成及產量影響的研究較多，學者普遍認為，營養鹽特別是氮的短缺或受限能夠加快微藻細胞內油脂的積累，并可能改變微藻的脂肪酸組成［6－7］。除此之外，其它因素如鹽度、光照等因素的改變也會使小球藻中脂肪酸的飽和度發生變化［8－9］。與BG11中小球藻油脂的累積相比，海水沖廁污水培養的小球藻的總脂含量和脂肪酸的種類均有所增加，可認為是鹽度、氮脅迫等多種因素共同作用的結果。

3 結論

（1）與BG11培養液相比，小球藻在以海水沖廁污水作為培養液時，其生長速率和生物量均明顯較低。

（2）小球藻能夠有效吸收海水沖廁污水中的氮、磷，培養12d時，對氨氮和總磷的去除率分別達到87.9%和98.2%，對CODCr的去除率為21.8%。

（3）采用海水沖廁污水培養出的小球藻細胞總脂含量較高，達到33.03%。海水沖廁污水中小球藻脂肪酸組成與采用BG11培養液培養的小球藻相比略有變化，但總體仍以C16和C18為主，符合作為生物柴油生產原料的要求。

總之，利用海水沖廁污水培養小球藻，可以在處理污水的同時產生微藻油脂，具有良好的發展前景和應用潛力。

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