甘肅不同地區綿羊TLR9 基因多態性分析

呂偉麗 張小麗 馬小軍，2 張國華

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070）

綿羊的呼吸道疾病主要是由羊肺炎支原體、巴氏桿菌、綠膿桿菌及C 群肺炎鏈球菌等病原微生物引起的呼吸道傳染病，主要以咳嗽、氣喘及肺炎為特征，羊患病后生長不良，掉膘，病情嚴重且得不到及時治療時會引起羊只死亡。綿羊呼吸道疾病在每年冬春發病，發病率和死亡率均較高，嚴重影響養羊業的發展［1-3］。隨著分子遺傳技術的發展，探討疾病控制的分子機制成為可能。免疫分子的Toll樣受體家族（Toll-like receptor，TLRs）的多態性或差異與動物對病原的抵抗力和易感性有著顯著的相關［4］。TLR 是單個的跨膜非催化性蛋白質，可以識別來源于微生物的具有保守結構的分子［5］。當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR 可以識別它們并激活機體產生免疫細胞應答［6］。TLR9 是TLRs 中的一員，可能是天然免疫識別微生物機制中對革蘭氏陰性菌表達的內毒素-脂多糖應答的受體［5，7］。TLR9 基因與呼吸道疾病抗性相關。本研究對綿羊該基因的遺傳多態性進行分析，結合表型觀測資料，初步確定易感等位基因和抗性較強的等位基因。研究表明Toll 樣受體（TLRs）是識別病原體和激活機體固有免疫的重要組成部分，與增加人對各種疾病的易感性有較大的關系，如艾滋病［3］、麻風病［8］，或者是動物如牛的副結核［1，2］，豬的沙門氏菌病［9］。脊椎動物的免疫系統中的甲基化的CpG 二核苷酸序列，其主要功能是識別侵入機體的細菌等［5］，這種識別PAMP 分子模式的受體稱為Toll 樣受體9［10］。在小鼠的抗原抗原呈遞細胞（APC）中合成含CpG 寡脫氧核苷酸（核苷酸），并模仿細菌的CpG 的核苷酸和誘導生產的細胞因子［10］，如B 細胞和樹突狀細胞（DC）［11］。據報道，綿羊和黃牛TLR 是蜂窩模式的CpG ODN 誘導，與人類有許多相似之處［12］。然而，這之間有種間差異也有種內差異，牛和羊因CpG 寡核苷酸的類型的不同而導致免疫反應不同，但對其原因缺乏深入了解［13］。有研究表明，面對體外環境（空氣灰層較多）和體內環境（細菌入侵）的變化，TLR 配體可能會受到Toll 樣受體基因單核苷酸多態性的影響，作出適應性反應，從而導致細菌感染或炎癥性疾病的易感性的改變［6］。目前在國內外還未見有關中國綿羊TLR9 基因的研究報道。本研究針對中國綿羊群體，收集表型正常和患有呼吸道疾病的個體基因組DNA樣品，開展TLR9 基因的遺傳多態性分析。利用已有的綿羊呼吸道病表型觀測和對應的基因組DNA 樣品為基礎，采用有效的SNPs 檢測方法PCR-SSCP，檢測綿羊TLR9 基因的遺傳多態性，通過序列測定確定變異類型，根據表型初步判定易感呼吸道疾病的等位基因。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在甘肅省山丹縣某規模化養殖場采集107 份表型正常的小尾寒羊血液樣品；甘肅省永昌縣某規模化羊場采集表型正常小尾寒羊血液樣品216 份，患呼吸道疾病的綿羊血液樣品36 份；甘肅省隴西縣某規模化羊場采集表型正常小尾寒羊血液樣品104 份，患呼吸道疾病的綿羊血液樣品22 份（表1）。每只羊均頸靜脈采血10 mL，檸檬酸葡萄糖（ACD）抗凝，-20℃凍存備用。

表1 綿羊樣品采集記錄

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用常規的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA 并溶解于TE 緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V 電泳檢測后，放于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計及PCR 擴增 采用Primer 5.0 引物設計軟件，根據GenBank 發表的綿羊TLR9 基因核苷酸全序列（AY859727）設計其核苷酸序列引物（上游引物：5'-TTCGTGGACCTGTCGGAC-3'，下游引物5'-CTGGCTGTTGTAGCTGAG-3'），擴增目的片段約為414 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

PCR 擴增采用20 μL 的體系，各成分用量：上下游引物個0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，滅菌ddH2O 6.4 μL，DNA-TAQ 預混酶12 μL。PCR 反應條件：預變性95℃ 1 min；變性95℃ 45 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 54 s，35 個循環；最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR 產物的SSCP 檢測 取2.5 μL PCR 產物，7.5 μL 變性劑（98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍、0.5 mol/L 混合而成），經105℃變性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（acr∶bis=37.5∶1），4℃、240 V，電泳24 h，結束后銀染法顯色。

1.2.4 TLR9 基因測序 SSCP 分析之后，選取不同基因型個體PCR 擴增產物送至上海生工生物基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 數據統計分析 用DNAMAN、Dnasp4.0［14］進行核苷酸變異位點、氨基酸變異位點的分析，系統發育樹的構建；Megalign［15］、Clustal［7］對所測的綿羊TLR9 基因序列進行同源序列比對分析。

2 結果

2.1 PCR擴增

對采集的綿羊TLR9 基因進行擴增，得到414 bp 的擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰且無雜物（圖1），可以進行下一步的SSCP分析。

圖1 TLR9 基因擴增產物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測結果

PCR 擴增產物經SSCP 分析，所檢測的485 只綿羊中共發現4 個等位基因，分別指定為TLR9 的*A、*B、*C、*D。各等位基因的電泳帶從1 條到5條不等，結果見圖2。

圖2 TLR9 基因SSCP 電泳圖譜

2.3 綿羊TLR9基因多態位點、等位基因頻率與氨基酸差異分析

本研究共確定4 個不同的序列（圖3）。在序列分析中，發現了7 個核苷酸多態位點，占分析位點總數的1.69%。其中轉換4 個，占核苷酸多態位點的57.14%，包括C/T 轉換1 個，G/A 轉換2 個，G/T轉換一個；顛換3 個，占多態位點總數42.86%。

用綿羊TLR9 部分基因序列推導出氨基酸序列（圖4），共有4 個氨基酸位點發生突變，其中單一氨基酸突變位點2 個。B 等位基因的72 bp 處C/T 和A、D 等位基因201 bp 處G/C，G/A 突變，沒有引起氨基酸的變化。

2.4 綿羊TLR9基因座位等位基因頻率

根據PCR-SSCP 的檢測結果，485 只綿羊TLR9基因存在的等位基因頻率分布情況（表2）。其中等位基因B 的頻率最高，達到51.13%，其次為等位基因 A。在觀測的485 只試驗綿羊中，表型正常的個體 427 只（健康未患呼吸道疾病），表型異常的58只（患有呼吸道疾病）。進一步分析發現，患呼吸道疾病羊只中等位基因 D 的頻率最高（表3）。

2.5 綿羊TLR9基因同源樹的構建

為了分析綿羊TLR9 基因的等位基因與其它相應等位基因間的遺傳關系，利用DNAMAN 軟件對TLR9 基因的序列進行同源樹的構建（圖5）。所用序列包括本研究獲得的4 個單倍型序列，從GenBank下載以下序列參與系統發育樹的構建：EF656460，JN377802，HQ717158，HQ717159，HQ717160，JN377803，HQ434578，EF656459，EF656458，NM001011555，AM231305，AM981307，GU451250，AY859727。圖5 顯示，綿羊TLR9 基因在國內外各個品種之間的同源性非常高，遺傳關系很近。

3 討論

3.1 綿羊TLR9基因多態性

研究表明，由于產生多態性的機制主要是基因突變和轉換，所以TLR9 基因多態性可能就是在長期的進化過程中等位基因的積累、融合與分化形成的。適應是形成TLR9 多態性的動因［6］，其多態性表現出明顯的適應意義，如抗病力增強，對環境的適應性增強等，這樣就會出現有利的選擇，群體中的基因頻率就會發生改變，有利的基因在群體中逐漸的積累；不利的基因會逐漸的消失。免疫系統的功能是決定家畜適應外界環境能力的因素［16］，由于家畜所處的環境（地理環境和氣候環境）的差別較大，為了更好適應所處的環境，機體的免疫系統會表現出豐富的多態性［17］，編碼TLR9 最主要功能區的基因也會表現出豐富的多態性。本研究在綿羊TLR9 基因中發現等位基因4 個，多態位點7 個，占序列總長度的1.67%，具有高度的多態性，這與綿羊所處的環境（甘肅省氣候干燥，空氣中灰塵中）所具有的適應性強，抗病性強的特點一致。

圖3 TLR9 等位基因核苷酸序列比對結果

圖4 TLR9 等位基因氨基酸序列對比結果

表2 綿羊TLR9 等位基因頻率

表3 患呼吸道綿羊TLR9 等位基因頻率

圖5 TLR9 基因核苷酸序列的同源樹

動物TLRs 與疾病的易感性和抗性有關［6］。TLR9 基因多態性和遺傳性的功能是防止機體受到疾病的感染。免疫學研究揭示，可以采用免疫遺傳標記開展選種工作，以提高畜禽的抗病力［18，19］。在動物的抗病育種中，許多研究表明TLRs 基因可能是一組重要的候選基因，能用于抗病分子的育種實踐之中。本研究選擇患呼吸道病的綿羊中，D 等位基因的頻率最高；未患呼吸道疾病（表型正常）的綿羊中，A、B 等位基因的頻率最高，可以初步推斷A、B 等位基因具有較強的抗呼吸道疾病的遺傳潛力。

3.2 TLR9基因聚類分析

TLR9 基因的同源樹圖表明，在綿羊的進化過程中，TLR9 基因最早可能來源于它們分歧之前的共同祖先原始序列，這可能是它們對相同病原微生物發生特定免疫反應的有效證據，具有相似性。

4 結論

研究獲得4 個TLR9 基因的等位基因，在該區域中發現了7 個SNPs，主要是由點突變形成的，說明綿羊TLR9 基因具有較豐富的多態性。

發現患有呼吸道病個體中等位基因D 的頻率最高，在4 個等位基因中都有出現。TLR9 基因多態性與綿羊呼吸道疾病有一定的相關性。

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