殺真菌素鏈霉菌AL-04 的篩選與鑒定

李增波 孫紅艷 趙靜嫻 周劍武 梁棟 高曄

（太原科技大學化學與生物工程學院，太原 030021）

近年來，隨著設施園藝的迅速發展，各種植物病害相繼出現，其中土傳真菌病害尤為嚴重，已成為制約設施農業發展的重要因素［1］。目前，土傳病害主要采用化學農藥進行防治，但防效不佳，且存在易污染環境、病原菌耐藥性及成本較高等問題，無法適應現代農業發展的需要。放線菌是農用抗生素的主要產生菌，其在防治土傳病害、改善植物營養和土壤理化性狀等方面具有顯著作用，正越來越受到人們的關注和重視［2］。本研究依賴本實驗室建立的放線菌庫，主要針對目前生產上發病面積較廣，對園藝作物生產影響較大的土傳真菌病害，采用瓊脂擴散法、生長速率法、孢子萌發抑制法及離體組織法，篩選高效且活性穩定的拮抗菌株，旨在探索新的土傳病害生防途徑，并為商品化生防菌劑的開發和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試放線菌 通過平皿體外試驗，從青藏高原土壤中分離純化到的4 500 余株放線菌［3，4］中篩選得到13 株放線菌。

1.1.2 活性檢測靶標菌 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici，代號為P3）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum，代號為H）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，代號為X）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，代號為F）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，代號為A）、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，代號為E）、青霉（Penicillium，代號為P）、白色假絲酵母（Candida albicans，代號為Y）、黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.），均由本實驗室保存。

1.1.3 培養基 肉胨培養基［5］、高氏1 號培養基［5］、PDA 培養基［5］、改良PDA 培養基［3］、黃豆粉培養基［3］、發酵培養基（黃豆粉 20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2 g，淀粉 10 g，酵母膏 2 g，NaCl 2 g，K2HPO41 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1 000 mL，pH7.2），所有試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

1.2.1.1 瓊脂擴散法［6］將13 株放線菌分別制成菌懸液，取100 μL 菌懸液涂布接種在黃豆粉培養基上，培養7 d 后，用打孔器打取7 mm 菌餅放入指示菌平板上，設3 個平行。于28℃培養3 d 后，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.1.2 生長速率法［6］將13 株放線菌分別制成孢子懸浮液，孢子懸浮液按10%（V/V）的接種量接種于裝有50 mL 發酵培養基的300 mL 搖瓶中，28℃，180 r/min 振蕩培養5 d 后，于5 000 r/min 離心，用0.22 μm 濾膜過濾除菌得到無細胞濾液。取5 mL 無細胞濾液，按濾液∶培養基=1∶5 的比例與25 mL的PDA 培養基（滅菌后冷卻至50℃左右）混合，待凝固后，將預先培養5 d 的7 mm 病原菌菌餅（西瓜枯萎、黃瓜枯萎、番茄灰霉、辣椒疫霉）放置于混配平板上，每個處理3 個平行，28℃培養72 h 后將培養皿取出，用游標卡尺測量菌落直徑（十字交叉測量兩次，取平均值），以3 次平行菌落直徑的平均值計算抑菌率。

1.2.1.3 真菌孢子萌發情況測定［7］取上述無細胞濾液1 mL，加入10 mL 無菌水，分別接入4 種真菌（黑曲霉、青霉、木霉和辣椒疫霉）孢子懸浮液100 μL，孢子濃度為鏡檢時40 倍視野下孢子數30-50 個。28℃培養6 h 后，取50 μL 于載玻片上，在40 倍鏡下觀察孢子萌發情況（萌發率和抑制率）。

1.2.1.4 離體葉片法［8］同1.2.1.2 方法得到13 株放線菌的無細胞濾液。取無細胞濾液20 mL 加入無菌培養皿，同時再取一個無菌培養皿加入20 mL 滅菌清水作為空白對照。剪取生長整齊一致的植物葉片（辣椒、黃瓜、番茄）用清水洗凈，分別放入裝有以上兩種溶液的平皿中浸泡30 min，取出葉片瀝干濾液，取無菌培養皿，放入一張與平皿大小一致的無菌濾紙，并加入無菌水4 mL，將已晾干的葉片放在吸水濾紙上，把一個活化好的直徑7 mm 的病原菌菌餅放于葉片上，蓋上平皿置28℃保溫保濕培養，檢查葉片染病情況及防治效果。每個處理50 個重復。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

1.2.2.1 形態特征 采用高氏1 號平板培養基進行埋片培養（30℃，7 d）。取埋片用2.5%戊二醛固定12 h 后，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）漂洗3次，轉入1%鋨酸溶液中固定1 h，再用上述緩沖液漂洗3 次，分別經50%-100%乙醇梯度脫水，置醋酸異戊酯中20 min，取出，臨界點干燥，噴金后于掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態特征［9］。

1.2.2.2 培養特征和生理生化特征 參照《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的標準培養基和常用生理生化方法培養、觀察和記錄［10］。

1.2.2.3 細胞化學分析 采用Hasegawa 等［11］和王平［12］改進的快速薄層層析法進行全細胞氨基酸及全細胞水解液糖型的分析。

1.2.2.4 抗藥性測定 把各種抗生素按一定濃度配制好，待滅完菌的高氏培養基的溫度降低到50℃左右時，再把抗生素加到培養基中充分混勻，倒平板備用。將預先培養好的菌體用接種針輕輕點接在平板上。以不加抗生素的高氏平板作為陰性對照，30℃下培養7-14 d 后記錄結果。培養基中抗生素利福平、諾弗沙星、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素的濃度為0.25 mg/mL，環丙沙星、青霉素濃度為5.0 mg/mL。

1.2.2.5 基于16S rDNA 基因序列的系統發育分析 參照文獻［13］的方法提取基因組DNA，然后PCR 擴增16S rDNA 基因。其中PCR 擴增引物采用通用引物，即正向Pf：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；反向Pr：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR 擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，35 個循環；72℃延伸10 min。PCR 產物純化與序列測定由上海生物工程公司完成。16S rDNA 基因測序后，利用Blast 搜索引擎從GenBank 數據庫中調出相關放線菌菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 軟件進行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，用Mega 3.1 軟件構建系統進化樹。

1.2.3 數據分析 采用Excel 2003 及SAS 8.2 進行相關處理的數據統計和方差分析。

2 結果

2.1 拮抗菌株的篩選

2.1.1 離體拮抗性試驗結果 為了獲得廣譜活性菌株，通過瓊脂平板拮抗性試驗，對13 株供試放線菌進行初篩。結果（表1）顯示，供試13 株放線菌均對4 種以上的病原菌有拮抗作用，抑菌圈直徑均在14.0 mm 以上。其中對5 種病原菌有抑制作用的菌株有AL-06、AL-07 和AL-10；對7 種病原菌有抑制作用的菌株有AL-03、AL-04，其中AL-04 的抑菌圈直徑平均為20.0 mm 以上，表現出較強的生物活性。

表1 13 株放線菌的抑菌圈直徑（mm）

2.1.2 供試菌株對病原菌菌絲生長的抑制作用 為了篩選到抗病原真菌的高效菌株，采用生長速率法對上述菌株進行驗證，結果（表2）顯示，對西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）抑制率達50%以上的菌株為AL-04、AL-06 和AL-10，其中AL-10 菌株的抑制率為93.9%；對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）抑制率達50%以上的菌株為AL-04、AL-05、AL-08 和AL-10，其中AL-04 的抑制率為85.7%；對番茄灰霉病菌（Botrytis cinere）抑制率達50%以上的菌株為AL-04、AL-10，其中AL-10 的抑制率為77.8%；對辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率達50%以上的菌株為AL-02、AL-03、AL-04、AL-05、AL-06、AL-10、AL-11 和AL-13，其中AL-02 的抑制率為95.3%。由此可知，供試13 株拮抗菌中，對4 種病原病菌抑制效果（抑制率>70%）的高效菌株為AL-04 和AL-10。

表2 13 株放線菌對4 種靶標菌的抑菌率（%）

2.1.3 供試菌株對指示菌孢子萌發的抑制作用 依據稻瘟篩選模型，以黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）作為指示菌，通過測定供試菌株發酵濾液對其孢子萌發率的影響，篩選抗植物病原真菌的高效拮抗菌株。結果（表3）顯示，13 株放線菌的發酵濾液對4 種指示菌孢子的萌發均有不同程度的抑制作用。抑制率均達到70.0%以上的菌株有AL-03、AL-04、AL-06、AL-07 和AL-10。同生長速率法結果一致，AL-04 和AL-10 兩株菌仍顯示出高效的拮抗活性。

表3 13 株放線菌對4 種靶標菌孢子萌發的抑制率（%）

2.1.4 離體葉片試驗結果 在生防菌的篩選過程中，經常會遇到室內試驗與田間試驗結果差距較大等問題，因而有必要建立離體植物組織篩選模式，以檢測生防菌的活性和生防效果。離體組織測定法是介于體外抗菌活性測定法和植物測定法之間的一種測定方法，它既可保證一定數量的菌株篩選，也能使測定條件比較接近大田條件。離體葉片法是離體組織測定法中最常用的一種方法，離體葉片法與植株法比較具有占用空間小、試驗條件容易控制、方便、快速等優點，是室內抗性鑒定的好方法。

辣椒、黃瓜、番茄均為常見園藝作物，其易受病害危害且材料容易獲取，因此取其進行離體葉片測定試驗。結果（表4）顯示，供試13 株放線菌對辣椒疫霉病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制作用有所不同：AL-02、AL-04、AL-10 和AL-11發酵液對辣椒疫霉的防治效果均在70.0%以上，其中AL-04 的 防 治 效 果 達90.0%；AL-04、AL-08 和AL-10 發酵液對番茄灰霉病菌均有抑制作用，防治效果在60%以上，其中AL-04 和AL-10 的防治效果為70.0%；AL-04、AL-05 和AL-10 發酵液對黃瓜枯萎病菌有抑制作用，其中，AL-05 和AL-10 的防治效果為70.0%，AL-04 的防治效果為80.0%。

從上述4 種方法的活性檢測試驗中發現，AL-04菌株始終表現出很強的生物活性，因此選定AL-04菌株進行下一步的研究。

表4 13 株放線菌對供試植物葉片的防治效果（%）

2.2 AL-04菌株的鑒定

2.2.1 形態特征 AL-04 放線菌在高氏1 號培養7 d，菌落呈白色至淡灰色、致密表面、邊緣光滑平坦（圖1-A）。光鏡和掃描電鏡觀察發現，該菌株基絲發育良好，呈現淺黃色，多分枝，無橫隔，不斷裂，氣絲生長旺盛，呈現淡紫灰色，寬0.4-0.5 μm，在氣絲上生有長孢子鏈，為松弛疏螺旋，孢子鏈長，分化為孢子，孢子球形至卵圓型，表面光滑無刺，直徑0.5 μm 左右（圖1-B 和1-C）。

2.2.2 培養特征 AL-04 菌株在葡萄糖-天冬酰胺瓊脂上基內菌絲為乳白色，氣生菌絲發達為淺橄欖石灰；在甘油-蘋果酸鈣瓊脂上，基內菌絲為杏仁黃，氣生菌絲為繭白色；在淀粉-酪蛋白瓊脂上，基內菌絲為荔肉白色，氣生菌絲為灰白色；在察貝克氏瓊脂上，基內菌絲為豆汁黃色，氣生菌絲為鴿子灰色；在麥芽汁-酵母膏瓊脂（ISP2）上，基內菌絲為乳白色，氣生菌絲為艾綠色；在燕麥片瓊脂（ISP3）上，基內菌絲為蓮子白色，氣生菌絲為銀灰色；在酵母膏-淀粉瓊脂上，基內菌絲為蚌肉白色，氣生菌絲為灰白色；在無機鹽-淀粉瓊脂（ISP4）上，基內菌絲為淡繭黃色，氣生菌絲為淡紫灰色；在甘油-天冬酰胺瓊脂（ISP5）上，基內菌絲為乳白色，氣生菌絲為淡綠色；在馬鈴薯塊上，基內菌絲為橄欖石灰色，氣生菌絲為淡紫灰色。該菌在各培養基上均無可溶性色素產生。

2.2.3 唯一碳、氮源利用和生理生化特征 AL-04菌株能利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、鼠李糖、蔗糖、DL-肌醇、D-甘露醇、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘油、山梨醇、丙酮酸、丁二酸鈉等碳源，不利用L-阿拉伯糖、棉子糖、醋酸鈉、檸檬酸鈉、草酸鈉、馬尿酸鈉、酒石酸鈉；可以利用酪氨酸、絲氨酸、DL-天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4等氮源。該菌能使明膠液化和分解纖維素，并使石蕊變藍和淀粉水解，硝酸鹽還原和卵磷脂酶反應陽性，不胨化和凝固牛奶，不產生H2S 和黑色素。最適生長溫度為24-32℃，低于14℃和高于38℃則停止生長。

2.2.4 細胞壁氨基酸分析 AL-04 菌株細胞壁中含有L-DAP（L 型二氨基庚二酸）和甘氨酸，屬于Ⅰ型細胞壁，符合鏈霉菌屬（Streptomyces）的化學分類特性。

2.2.5 耐藥性分析 AL-04 菌株能在利福平、環丙沙星、諾氟沙星、紅霉素、氯霉素、青霉素、氨芐青霉素的平板上生長，不能在鏈霉素慶、大霉素、卡那霉素的平板上生長。

圖2 基于16S rDNA 的系統發育樹

2.2.6 分子鑒定結果 菌株AL-04 的16S rDNA 核酸序列長度為1 448 bp，GenBank 登錄號為JN368424。通過與NCBI 中模式菌株的16S rDNA 序列比對分析和系統發育樹的構建（圖2），發現菌株AL-04 與殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）的4 個菌株在進化樹上位于同一個分支，其中與Streptomyces fungicidicus MML1614（EU344795）同源性達到99.6%。因此，參照鏈霉菌的分類鑒定手冊，結合菌株AL-04 的形態特征、培養特征、生理生化特征以及細胞壁化學分析，將菌株AL-04 歸為殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

3 討論

活性菌株初篩法多采用平皿拮抗測定和活體植株測定，前者雖反映離體抑菌作用，但與盆栽及大田植株測定結果相關性很低，而后者工作量又太大，影響篩選進度。本研究采用蔬菜離體葉片平皿培養測定法則可彌補兩者不足之處，它可以把體外無效、體內有效的活性菌株篩選出來，極大地縮短初篩周期并提高篩選的準確性。在該方法的基礎上再進行盆栽及大田測定，可顯著減少工作量，提高篩選水平。

實踐證明，新型高效農用抗生素的發現與新的篩選模型的構建關系緊密。如以觀察稻瘟菌分生孢子或菌絲形態生長異常為指標的簡易微管測試體系［16］，篩選出多種具有抗有絲分裂、抗真菌活性的新化合物，其中rhizoxin 和fusaridin A 已開發為抗腫瘤、抗真菌新藥［17，18］。國內的林厚文等［19］利用該模型篩選到海兔中抗有絲分裂活性組分；鮑時翔等［20］參照該模型建立了鐮刀菌篩選模型，并將其與腫瘤細胞毒篩選模型組合，應用于海洋微生物抗腫瘤活性物質的篩選。孢子萌發法篩選病原真菌的拮抗菌株時，常常需要培育病原菌的孢子，但其培養存在費時費力和離體條件毒性不高的弊端，能否采用更簡潔的方法用于活性菌株的篩選，特別是應用于大量備選菌株庫的初篩工作，是菌株篩選過程中亟待解決的問題。本研究借鑒稻瘟菌篩選模型，以黑曲霉、木霉和青霉3 種常見非植物病原真菌和植物病原真菌辣椒疫霉作為指示菌，進行孢子萌發抑制試驗。結果顯示，對4 種指示菌孢子萌發抑制率均達到70.0%以上的活性菌株占供試菌株總數的38.5%，這部分活性菌株對3 種非植物病原真菌孢子萌發抑制率達到73%-98%，同時對病原真菌的孢子萌發抑制率也達到了70%-88%，說明活性菌株對非病原真菌和病原真菌的抑制作用存在一定的偶聯關系，而且黑曲霉、木霉和青霉產孢子比辣椒疫霉產孢子更加容易，檢測時從加樣到觀察所需時間更短（前者只需6-10 h，而后者一般要12-16 h）。因此，上述試驗結果提供了一個農用抗生素篩選模型的新思路，即活性菌株若對易培養真菌孢子萌發有抑制作用，其很可能對病原真菌孢子也存在一定的抑制作用。因此，在實際操作過程中，可以選擇易培養的非病原真菌作為初篩工作的靶標菌，從而縮短篩選周期。本研究結果是對該思路的一個初步探索，其驗證工作還有待進一步的研究。

4 結論

參照稻瘟菌篩選模型，以非植物病原真菌和植物病原真菌作為指示菌，篩選到一株具有廣譜的抗菌活性的菌株AL-04，其對幾種常見的園藝植物土傳病害病原真菌都有較強的抑制效果，抑制率超過70.0%，其中對辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率高達93.0%，有較高的應用價值。經形態、培養特征、生理生化特征、全細胞壁氨基酸和糖型分析以及16S rDNA 序列聚類分析，將AL-04 鑒定為殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

［1］ 李忠, 張翊, 吳小毛, 等.植物土傳病害生防細菌的篩選、鑒定及特性研究［J］.河南農業科學, 2013, 42（4）：103-106.

［2］ 武志杰, 梁文舉, 李培軍, 等.我國無公害農業的發展現狀及對策［J］.科技導報, 2001, 2：47-50.

［3］ 顏霞, 朱銘莪, 薛泉宏, 等.西藏亞高山草原土壤放線菌研究［J］.西北農業學報, 1999, 8（2）：97-101.

［4］ 蔡艷, 薛泉宏, 陳占全, 等.青海省保護地辣椒根際土壤和根表放線菌研究［J］.應用與環境工程學報, 2003, 9（1）：92-96.

［5］ 程麗娟, 薛泉宏, 來航線, 等.微生物學實驗技術［M］.西安：世界圖書出版社, 2000.

［6］ 韓斯琴. D2-4 放線菌的篩選及其抗生物質研究［D］.沈陽：中國科學院沈陽應用生態研究所, 2003.

［7］ 胡志鈺.海洋動植物共附生放線菌農抗活性物質的初步研究［D］. 廈門：廈門大學, 2001.

［8］ 丁立孝, 何國慶, 孔青.一種新的農用抗生素初篩方法［J］.農業生物技術學報, 2002, 10（4）：409-410.

［9］ 康振生.植物病原真菌的超微結構［M］.北京：中國科學技術出版社, 1996.

［10］ 中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌分類手冊［M］.北京：科學出版社, 1975.

［11］ Hasegawa T, Takizawa M, Tanid AS. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes［J］. Gen Appl Microbiol, 1983, 29（4）：319-322.

［12］ 王平.測定放線菌菌體中氨基酸和單糖的快速方法-薄層層析法［J］.微生物學通報, 1986, 13：228-230.

［13］ 徐平, 李文均, 徐麗, 等.微波法快速提取放線菌基因組DNA［J］.微生物學通報, 2003, 4：82-84.

［14］ 方中達.植病研究方法［M］. 第3 版. 北京：中國農業出版社, 1998.

［15］ 孔建, 王文夕, 趙白鴿.枯草芽孢桿菌B-903 菌株的研究Ⅰ對植物病原菌的抑制作用和防治試驗［J］.中國生物防治, 1999, 15（4）：157-161.

［16］ Kobayashi H, Namikoshi M, Yoshimoto T, et al. A screening method for antimitotic and antifungal substances using conidia of Pyricularia oryzae, modification and application to tropical marine fungi［J］. Journal of Antibiotics, 1996, 49（9）：873-879.

［17］ Tsuruo T, Oh-hara T, Lida H, et al. Rhizoxin, a macrocyclic lactone antibiotic, as a new antitumor agent against human and murine tumor cells and their vincristine-resistant sublines［J］. Cancer Research, 1986, 46：381-385.

［18］ Kobayashi H, Sunaga R, Furihata K. Isolation and structures of an antifungal antibiotic, fusarielin A, and related compounds produced by a Fusaruim sp.［J］. Journal of Antibiotics, 1995, 48（1）：42-52.

［19］ 林厚文, 湯海峰, 易楊華, 等.利用稻瘟霉分生孢子篩選海兔抗有絲分裂活性組分［J］.中國中藥雜志, 2002, 27（1）：53-55.

［20］ 鮑時翔, 林茂, 黃惠琴, 等.利用組合篩選模型篩選海洋微生物抗腫瘤活性物質［J］.中國海洋藥物, 2003, 22（1）：45-48.