天目山野生春蘭根中可培養內生細菌多樣性研究

武永秀 宋彤彤 張瑞英 劉亮 邵紅 李潞濱 孫磊

（1.河北大學生命科學學院 河北省微生物多樣性研究與應用實驗室，保定 071002；2.中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；3.浙江天目山國家級自然保護區管理局，臨安 311311）

植物內生細菌是植物微生態系統中的重要組成部分，具有多種有益的生物學功能，已成為植物微生物學科具有挑戰性的研究領域。植物內生細菌是指生活在植物組織內部，沒有給植物造成實質性損害，或者除了定居還從中獲益的細菌［1］。內生細菌可以定殖在根、莖、葉、花、果實、種子等不同器官［2，3］。許多內生細菌在離體條件下都可表現出對植物有益的特性，但是只有少數細菌被證實可高效促進植物生長，或在農業條件下具有生防作用［4，5］。因此加深對植物內生細菌的研究，闡明它們的作用，必可促進其在可持續農業中的應用。

春蘭（Cymbidium goeringii Rchb. f.）為多年生地生型草本植物，屬于蘭科蘭屬，是中國蘭花的代表之一，主要分布于陜西、甘肅、河南至華東、華南和西南各省區，以江蘇、浙江所產春蘭為貴。目前，對春蘭植物內生細菌的研究報道較少，本實驗室曾以溫室栽培春蘭為材料，對其內生細菌分離條件及根內可分泌IAA、鐵載體的細菌多樣性進行研究［6-8］。本研究通過對采自浙江天目山的野生春蘭根內可培養細菌多樣性的研究，以期豐富植物內生細菌資源，并為植物-微生物相互作用關系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2009 年3 月自浙江省天目山共采集5 株健康春蘭，空運回實驗室后立即進行內生細菌分離。

1.2 方法

1.2.1 野生春蘭根內生細菌的分離 5 株健康春蘭每株取根1 g，無菌水沖洗根表面土壤，混合樣品后用于內生細菌的分離。首先對根進行表面滅菌，表面滅菌條件參照劉琳等［7］方法：75%乙醇浸泡3 min，3%次氯酸鈉溶液處理2 min，75%乙醇浸泡30 s，最后用無菌水沖洗。取最后一次沖洗水涂布于R2A 平板并將處理后的根組織于R2A 平板上輕壓涂抹，28℃暗培養6 d，無菌落生成則表示表面滅菌合格。將表面滅菌合格的根置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水及少量的無菌石英砂研磨，研磨液梯度稀釋后涂布R2A 培養基（Difco）和TSA 培養基（Difco）平板，各設3 個平行，28℃。挑取適當稀釋度平板上的所有菌落，純化后4℃保藏備用。

1.2.2 根內生細菌的16S rDNA 序列擴增 菌落裂解法［9］制備反應模板。采用細菌16S rDNA 通用引物［10］27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（上海英駿生物技術有限責任公司合成）進行擴增。PCR 反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30 個循環；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物。

1.2.3 根內生細菌的16S rDNA 序列測定及系統發育分析 對所有菌株進行16S rDNA 序列測定。測序結果利用BLAST 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）與GenBank 數據庫中的序列進行比對分析，選取同源性最高的且有效發表的菌株序列，利用MEGA5.1 軟件（http：//www.megasoftware.net/mega5.1.html）進行分析，用Clustal W 按照最大同源性的原則進行排序，采用Kimura-2 計算核苷酸差異值，最后用鄰接法（Neighbor-Joining method）構建系統發育樹［11］。

1.2.4 多樣性指數計算 根據序列比對結果計算不同培養基獲得的香濃-威納多樣性指數（Shannon-Weaver index，H）。計算公式為：H=-PilnPi，式中，Pi 為第i 種細菌占該細菌總數的比率。

2 結果

2.1 野生春蘭根內生細菌的種群數量

將采集的野生春蘭根樣品表面滅菌后進行內生細菌的分離培養，同時檢測表面滅菌效果。5 d 后檢測平板無菌落形成，證明表面滅菌徹底，分離結果可用。根據菌落形態進行分類、編號、純化，最終從野生春蘭根中得到內生細菌63 株，其中R2A 培養基中得到56 株，TSA 培養基中得到7 株。R2A培養基獲得的內生細菌種群數量為4×104cfu/g fw，TSA 培養基獲得的細菌種群數量為0.5×104cfu/g fw。

2.2 野生春蘭根內生細菌的多樣性分析

測定63 株春蘭內生細菌的16S rDNA 序列，將測定的序列登錄GenBank，登錄號為：KF751813-KF751823。將測序結果與GenBank 數據庫中的序列進行比對分析，序列分析結果（表1）表明，63 株內生細菌分屬于變形菌門的β-變形菌綱（31.74%）、γ-變形菌綱（7.94%）以及厚壁菌門（60.32%）的6 個屬的8 個種，其中芽孢桿菌屬為最優勢菌屬（50.79%）。分離自R2A 培養基的56 株內生細菌分屬于伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Dyella 菌屬、芽孢桿菌屬（Bacillus）和Lysinibacillus 屬。31 株細菌屬于芽孢桿菌屬，為最優勢菌屬，占R2A 培養基分離總菌數的55.36%；20 株細菌屬于伯克氏菌屬，為次優勢菌屬，占分離總菌數的35.71%。分離自TSA 培養基的7 株細菌分屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、Lysinibacillus 屬及類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），假單胞菌屬的細菌占TSA 培養基分離總菌數的42.86%。由比對結果構建的系統發育樹見圖1。計算結果顯示，天目山野生春蘭根內生細菌香濃-威納多樣性指數為1.56，而R2A 培養基及TSA 培養基獲得的天目山野生春蘭根內生細菌多樣性指數分別為1.36 和1.28。

表1 天目山野生春蘭根內生細菌16S rDNA 序列相似性分析

圖1 天目山野生春蘭可培養內生細菌的16S rDNA 系統發育樹

3 討論

本研究分離出的野生春蘭根內生細菌的優勢菌屬為芽孢桿菌屬（58.7%）和伯克氏菌屬（31.7%）。該兩個屬的細菌作為有益植物內生細菌研究較多，報道顯示伯克氏菌屬具有固氮功能［12］，ACC 脫氨基酶活性［13］，可分泌IAA、鐵載體［6，7］及生物防治［14］等多種生物學活性。芽孢桿菌屬細菌作為常見的可培養的植物內生細菌對一些植物病害有較好的防治效果，并且對植物的生長具有促生作用［15］。我們從天目山野生春蘭根內也分離到了1 株與Dyella 屬細菌16S rDNA 相似性很高的菌株，目前Dyella 屬有8 個已知種，均分離自土壤，作為植物內生細菌僅見劉琳等［7］從溫室盆栽春蘭根內分離出一株可分泌IAA 的Dyella sp.，這在一定程度上證明植物基因型對內生細菌具有選擇性。

自報道可從表面滅菌的植物當中分離獲得細菌［16，17］開始，到現在通過培養方法和非培養方法已發現了200 個屬的細菌可作為植物內生細菌存在。研究和報道最多是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的細菌。本研究從天目山野生春蘭根內只分離到了變形菌門和厚壁菌門的細菌，且僅歸屬于6 個屬的8個種。本實驗室從溫室盆栽春蘭根中分離到的可分泌IAA的細菌屬于18個已知屬和兩個潛在的新屬［7］，分泌鐵載體的細菌屬于17 個已知屬［6］。可見溫室盆栽春蘭根內生細菌多樣性遠遠高于浙江天目山的野生春蘭。這可能是由于野生春蘭生長過程中自然條件多變，造成內生細菌的生存環境多變不穩定；取樣時間為3 月份，植物剛剛越冬進入生長時期，也可能是造成細菌多樣性較低的另一原因。比較兩種培養基分離的結果發現不論是從種群數量還是多樣性，R2A 培養基獲得數據均高于TSA 培養基，R2A培養基更適用于野生春蘭內生細菌的分離。本研究結果表明初春季節天目山野生春蘭根內生可培養細菌多樣性較低。本研究豐富了植物內生細菌資源庫，對新物種資源的發現起到了重要的作用，為有益內生細菌的綜合利用提供了科學依據。

4 結論

本研究獲得的天目山野生春蘭根內生細菌分屬于變形菌門和厚壁菌門的6 個屬的8 個種，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）為最優勢菌屬，其余菌分屬于伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Dyella 菌 屬、Lysinibacillus 屬 和 類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

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