UL27、UL29 基因shRNA 表達載體的構建及對HSV-2 的干擾效應研究

呂延成 潘曉瑜 黃暢 丁娟

（遵義醫學院珠海校區 生化與分子細胞生物學教研室，珠海 519040）

Ⅱ型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）是生殖器皰疹（GH）的主要病原體。HSV-2 一旦感染將終身潛伏在骶神經節［1，2］。近年來的研究認為，Ⅱ型單純皰疹病毒感染和艾滋病［3］、宮頸癌的發病密切相關性［4-7］，國內外研究顯示HSV-2 患病率呈不斷上升趨勢［8］。目前治療生殖器皰疹主要使用廣譜抗病毒藥物，治療的目的主要是緩解癥狀，縮短病程，減輕疼痛及防止繼發感染等［9，10］。同時隨著各種激素的大量使用，HSV-2病毒耐藥性有逐漸增加的趨勢［11，12］。因此，尋找新的抗病毒治療策略，研制新型抗病毒藥物已成為當今HSV-2 感染后治療的研究熱點。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）能夠使mRNA 發生降解而導致基因表達沉默，是一種新型的基因阻斷技術，能高效、特異的抑制基因表達。運用RNAi 干擾技術抑制病毒增殖和感染是當前抗病毒研究領域的熱點之一［13-16］，目前國內外運用RNAi 技術，特別是聯合干擾對HSV-2 的研究報道較少。

HSV-2 是生殖器皰疹的主要病原體，UL27、UL29 都在病毒感染過程中起重要作用，因此以UL27 基因、UL29 基因為靶點的治療具有廣闊前景。HSV-2 UL27 基因編碼的gB 蛋白是在感染細胞中含量最多的糖蛋白，gB 的胞漿區是12 個包膜糖蛋白中最長的，提示它在感染過程中起重要作用。gB 以寡聚體形式存在于病毒包膜上，并與細胞膜上氨基聚糖硫酸乙酰肝素或硫酸軟骨素結合，使病毒吸附于宿主細胞膜上，介導病毒包膜與細胞膜融合、病毒穿入和胞間擴散，引發病毒循環復制過程。gB 是宿主細胞免疫和體液免疫的主要靶標，也是HSV-2特異性細胞毒性T 淋巴細胞的主要靶標。gB 表達缺失必定影響病毒吸附和穿入細胞，從而抑制HSV-2的感染。UL29 基因編碼合成的ICP8 蛋白單鏈DNA結合蛋白，調控病毒DNA 復制和γ 基因的表達。研究表明，該蛋白是病毒復制所必須的，一旦發生突變則可影響晚期基因的表達和DNA 的合成。該蛋白主要作用是結合病毒RNA 從細胞核運輸到細胞質，抑制pre-mRNA 的剪切等。

本研究利用RNA 干擾技術，針對HSV-2 UL27、UL29 基因分別設計、合成8 對寡核苷酸，采用基因重組技術構建shRNA 表達載體，通過脂質體轉染法將shRNA 表達載體轉入細胞后表達siRNA，再接種HSV-2。通過實時熒光定量PCR 法檢測UL27、UL29 mRNA 的轉錄水平，分析shRNA 表達載體對UL27 和UL29 基因的抑制效果。篩選出干擾效率高的表達載體，進行聯合干擾試驗，用終點滴定法檢測干擾后的子代病毒滴度；用MTT 法檢測細胞的存活率；用蛋白免疫印跡技術檢測目的基因蛋白表達水平。旨在為進一步研究通過RNAi 手段抑制HSV-2 的關鍵基因的表達治療HSV-2 提供試驗依據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293 細 胞、大 腸 桿 菌DH5α 由 遵 義 醫 學院珠海校區中心實驗室提供；HSV-2 333 標準株來源于美國標準生物品收藏中心（ATCC）；質粒pGPU6/GFP/Neo 全長5 117 bp，購自上海吉瑪制藥技術有限公司。限制性內切酶BamH I、Bbs I、Pst I 購自美國Fermentas，T4 DNA 連接酶購自杭州碧云天生物技術研究所，RNA 提取試劑RNAisoTMPlus、SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit 購自寶生物工程（中國大連）有限公司，DMEM 培養基購自美國GIBCO，新生牛血清購自杭州四季青公司，轉染試劑Lipofectamine2000 購自Invitrogen 公司，鼠抗gB、ICP8 單抗購自美國Santa cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 表達載體的構建 從GenBank 上獲得HSV-2（NC_001798）UL27 和UL29 基因序列，利用Invitrongen 公司的shRNA 在線設計軟件，進行靶序列的初篩。用Blast 檢索將初篩的靶序列與其他人類基因組進行比對，通過RNA structure 5.0 軟件對靶mRNA 的二級結構進行模擬分析，篩選出4 條特異性序列作為靶序列，同時在試驗中設計不針對任何基因的序列為陰性對照（Negative control，NC），見表1。

表1 篩選的HSV-2UL27、UL29 靶序列

表1 中 DNA 序列由上海吉瑪制藥技術有限公司化學合成，將寡核苷酸鏈退火形成shRNA 模板雙鏈，通過T4 連接酶連接到pGPU6/GFP/Neo 上，形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達重組載體，轉化后挑取單菌落，擴大培養后提取質粒，用Pst I、BamH I進行酶切鑒定。

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達載體轉染HEK-293 細胞 HEK293 細胞在10% FBS 的DMEM 培養液中，37℃，5% CO2條件下培養。取對數生長期的HEK293 細胞以4×104-5×104個/孔接種于24 孔板，待細胞豐度到80%時，用100 μL 質粒/lipofectamin2000 復合物加到含有細胞24 孔培養板的孔中，繼續培養48 h 后；試驗分為4 組：空白組（空載體）、陰性對照組（shRNA NC）、對照組（shRNAGAPDH）、各干擾組，每組設3 個復孔，分別于12、24、36 和48 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 表達情況，收集細胞，用流式細胞儀檢測，計算含有熒光的細胞占總細胞數的百分比。

轉染效率（%）=熒光細胞數量/細胞總數×100%

1.2.3 HSV-2 感染HEK293 細胞 HSV-2 接種HEK-293 細胞，用2%病毒維持液培養病毒，反復凍融法收獲子代病毒。采用終點滴定法測定病毒滴度。按Reed-Muench 法計算，能引起50%細胞發生病變的病毒最高稀釋度（50% tissue culture infective dose，TCID50），即病毒滴度。各試驗組在37℃，5% CO2飽和濕度培養箱中培養48 h 后，再接種TCID50病毒。1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測UL27 基因的轉錄水平 病毒感染48 h 后，抽提細胞總RNA，進行反轉錄。采用實時定量PCR 儀進行PCR 擴增，用SYBRGreen I 檢測。以GAPDH 作為內參檢測各組細胞內mRNA 表達水平，引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下：內參GAPDH 上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；UL27 上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，62℃ 30 s，70℃ 30 s，共40 個循環。反應結束后，以每孔GAPDH 的定量作為標準，分別校正各孔UL27 基因表達的差異，各組表達量采用2-△△Ct計算。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達 細胞接種HSV-2 48 h 后，收集細胞，提取蛋白。采用BCA 法測定蛋白質濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，通過電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF 膜。后者在含5%脫脂奶粉的PBST 中37℃封閉90 min，加入一抗4℃孵育過夜；PBST 充分漂洗（10 min×3 次），加入二抗37℃作用40 min；PBST 充分漂洗（10 min×3 次）；化學熒光法（ECL）顯色，以GADPH 蛋白為內參照，曝光獲取圖像，比較各組蛋白表達量。

1.2.6 子代病毒滴定及MTT 法測定293 細胞存活率 細胞轉染siRNA 并感染病毒后，使用終點滴定法，對上述收集的子代病毒液進行病毒滴度測定，采用MTT 法，對細胞的存活率進行測定。

1.2.7 統計學處理 用SPSS13.0 軟件進行統計分析，所有數據采用均數標準差（x-±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD 檢驗。P<0.05 表示顯著性差異。

2 結果

2.1 表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鑒定結果

shRNA 模板成功插入到質粒pGPU6/GFP/Neo 上時，原質粒上的Pst I 酶切位點被置換消失。如果構建成功，則pGPU6/GFP/Neo-shRNA 可以被BamH I切開，而不能被Pst I 切開。Pst I 酶切結果顯示有兩條帶，分別為超螺旋的SC 構型和質粒的松弛開環OC 構型，這兩條帶可以證明重組質粒不能被Pst I 酶切。重組體被BamH I 單酶切而線性化，條帶在5 100 bp 左右（圖1）。

圖1 重組質粒的Pst Ⅰ和BamH Ⅰ酶切電泳圖譜

2.2 細胞轉染效率測定

pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達載體轉染HEK293細胞轉染48 h 后，GFP 的表達達到高峰。流式細胞儀測得轉染后12、24 和48 h 含有熒光的細胞占細胞數的百分比分別為22.5%、37.5%和80%（圖2，圖3）。可見轉染48 h 后，轉染效率最好。

圖2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 重組載體轉染細胞48 h 圖像（100×）

2.3 HSV-2病毒滴度測定

通過終點滴定法測定HSV-2 病毒TCID50，以確定感染細胞所需的病毒量。計算結果顯示，TCID50為10-3.5/100 μL。表2 顯示，能使50%細胞出現病變的稀釋度在10-3與10-4之間。

圖3 流式細胞儀測定轉染效率

表2 HSV-2 病毒滴度滴定結果

2.4 HEK293細胞形態學改變

各組shRNA 轉染細胞并感染HSV-2 48 h 后，以正常細胞空白組、陰性對照組（shRNA NC）為參照，觀察細胞病變情況。結果（圖4）顯示，接種24 h 后，可見陰性組多數細胞融合為多核巨細胞。接種48 h后，大部分細胞脫落，多核巨細胞裂解為細胞碎片。以正常細胞為對照，干擾組細胞均出現不同程度的細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE）。

圖4 各組HEK293 細胞的CPE（100×）

2.5 shRNA表達載體對UL27、UL29mRNA各組的抑制效果

接種HSV-2 48 h 后，用熒光定量PCR 法檢測各組細胞內HSV-2 mRNA 的表達量。圖5 顯示在單干擾組中UL27 shRNA75 對UL27mRNA 的抑制率最高，為75.17%，UL29 shRNA1461 對UL29mRNA 的抑制率最高，為66.08%。

2.6 UL27、UL29聯合干擾表達載體對mRNA的抑制效果

聯合干擾組接種HSV-2 48 h 后，實時熒光定量PCR 法檢測各組細胞mRNA。結果（表3）顯示，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯合組對UL27 基因表達的CT 值為30.16±0.11，對UL29 基因表達的CT 值為28.72±0.24，聯合干擾組與空白對照組比較具有顯著性差異（P<0.05）；而陰性對照組與空白對照組相比，無顯著性差異（P>0.05）。

圖5 shRNA 表達載體對UL27、UL29mRNA 的抑制效率

表3 shRNA 聯合表達載體對mRNA 的抑制效果

2.7 終點滴定法測定子代病毒滴度

HEK293 各組細胞接種HSV-2 48 h 后，收集子代病毒液進行病毒滴度測定，病毒滴度用TCID50計算。與空白對照組、陰性對照組比較，干擾組（UL29 shRNA939 和UL29 shRNA1653）病毒滴度有下降，但未有顯著性差異（P>0.05）；其余各干擾組病毒滴度均有不同程度下降，有極顯著性差異（P<0.01）。

表4 轉染后各組的病毒滴度測定

2.8 shRNA質粒表達載體對HSV-2蛋白表達效果的影響

各轉染組接種病毒48 h 后，分別收集細胞提取蛋白，然后經電泳，轉印后，加入gB 抗體和ICP8 抗體對目的蛋白進行檢測，其中UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯合干擾組與單干擾組相比，蛋白表達量明顯減少（P<0.05）（圖6）。

2.9 MTT法檢測293細胞存活率

各轉染組接種病毒48 h 后，棄上清加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀下讀取吸光度，計算細胞存活率。結果（圖7）顯示，聯合干擾組UL27 shRNA75+ UL29 shRNA1461 的細胞存活率最高。

3 討論

近年來，對RNAi 的研究現狀分析，在哺乳類動物中，RNAi 并不能完全阻斷基因的表達，對阻斷基因的mRNA 水平表達量有一定的限度［17］，siRNA 在 細 胞 內 與RISCs（RNA-induced silencing complexes）結合后，通過其識別并沉默相應的mRNA，RISCs 有一定的飽和度，過多的siRNA 反而可能抑制其活性，也不可能無限增大siRNA 的濃度。因此將兩種基因或者多個基因的分子靶向治療相結合正成為日益活躍的研究領域。其原因有：其一，由于病毒感染是一個多因素、多階段、多基因參與的復雜過程，病毒對不同的基因治療的敏感性有差異，單一的基因治療往往不能取得良好的療效，隨著病毒的突變，可能在一定程度上抵消其作用，聯合基因治療有望提高療效。其二，采取不同的治療途徑，利用各個基因治療的優點，提高治療效果，降低對機體正常組織的副作用。

因此本試驗針對HSV-2 UL27 和UL29 基因各篩選出的4 條靶序列構建特異性shRNA 質粒表達載體，在體外細胞水平上觀察研究RNAi 對HSV-2 的抑制效應以及二者聯合干擾對HSV-2 的抑制效應。試驗中UL27、UL29 各篩選出的4 條靶序列的沉默效果各有差異，其中在mRNA 水平上的單干擾組中UL27 shRNA75 組對UL27 基因mRNA 的抑制率為75.17%，UL29 shRNA1461 組對UL29 基因mRNA 抑制率為66.08%，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461聯合干擾組對UL27 基因抑制率約為91.28%，UL29基因表達抑制率約為80.40%，并用Western blotting 技術在蛋白水平上得到驗證。在此基礎上，進一步從子代的病毒滴度的變化、細胞的形態學變化和細胞的存活率等方面檢測pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重組表達載體對HSV-2 復制的影響。經空白對照組和陰性對照組及各單干擾組的比較說明，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯合干擾組的子代病毒滴度最低，細胞的存活率也更高，說明其能更好地抑制HSV-2 的復制。

由此可見，HSV-2 UL27 基因在病毒感染階段起關鍵作用，而UL29 基因都在病毒復制過程中起重要作用，因此聯合干擾二者的合成，對阻止HSV-2病毒吸附和穿入以及干擾病毒DNA 合成復制，從而抑制HSV-2 病毒的感染與復制。本試驗結果表明聯合靶向干擾效果優于各自的單個干擾，顯示兩個基因之間具有相互協同效應，能夠相互聯合增強對單一基因的抑制。HSV-2 復制循環包括吸附、穿入、脫衣殼、DNA 復制、轉錄、翻譯、蛋白質合成、核衣殼組裝和病毒釋放等順序過程。可能缺失了gB 的病毒就喪失了感染的能力，導致之后整體的HSV-2的DNA 復制就下降了。基于基因之間的相互聯系和作用，導致相應的單鏈DNA 結合蛋白也會減少，從而進一步抑制HSV-2 DNA 的復制。提示聯合靶向特異性shRNA可能從不同途徑阻止HSV-2感染和復制，還可能減少shRNA 抗病毒感染過程中出現病毒變異株的概率。

圖6 Westernblot 檢測gB 和ICP8 蛋白的表達結果

圖7 MTT 法測定293 細胞存活率

HSV-2 在宿主細胞內的復制增殖由多種病毒蛋白和宿主蛋白之間的協同作用所決定，因此可以進一步研究針對不同的病毒關鍵基因，如ICP4、UL54、US3 等進行多個靶點shRNA 的設計，亦可將UL27 和UL29 的特異性siRNA 構建于同一個shRNA重組表達載體，或者同一基因的兩個特異性siRNA構建于同一個表達載體，轉染進入細胞，這些方法可能會產生更高效的抑制作用。

4 結論

本研究成功構建并篩選了有效抑制病毒復制的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重 組表達載體，轉染HEK293 細胞，可以降低子代的病毒滴度、抑制UL27、UL29 基因的mRNA 和蛋白的表達，提高細胞的存活率。

［1］ Jin L, Carpenter D, Moerdyk-Schauwecker M, et al. Cellular FLIP can substitute for the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript gene to support a wild-type virus reactivation phenotype in mice［J］. Neurovirol, 2008, 14（5）：389-400.

［2］ Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, et al. A putative RNAinterference-based immune system in prokaryotes：computational analysis of the predicted enzymatic machinery functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action［J］. Biol Direct, 2006, 1：7.

［3］ Gondi CS, Rao JS. Concepts in in vivo siRNA delivery for cancer therapy［J］. Cell Physiol, 2009, 220（2）：285-291.

［4］ Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi［J］. Nat Biotechnol, 2003, 21（6）：635-637.

［5］ Kopp SJ, Storti CS, Muller WJ. Herpes simplex virus-2 glycoprotein interaction with HVEM influences virus-specific recall cellular responses at the Mucosa［J］. Clin Dev Immunol, 2012, 2012：284104.

［6］ Chew GT, Watts GF. HSV-2 and atherosclerosis：adding to the alphabet soup of coronary risk in HIV infection［J］. Atherosclerosis, 2012, 223（2）：278-279.

［7］ Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al. Short hairpin RNAs（shRNAs）induce sequence-specific silencing in mammalian cells［J］. Genes Dev, 2002, 16（8）：948-958.

［8］ McMaIlus MT, Petersen CP, Hailles BB, et al. Gene silencillg using micro-RNA designed hairpins［J］. RNA, 2002, 8（6）：842-850.

［9］ Hoshino Y, Pesnicak L, Straus SE, et al. Impairment in reactivation of a latency associated transcript（LAT）-deficient HSV-2 is not solely dependent on the latent viral load or the number of CD8（+）T cells infiltrating the ganglia［J］. Virology, 2009, 387（1）：193-199.

［10］ Paul CP, Good PD, Winer I, et al. Effective expression of small interfering RNA in human cells［J］. Nat Biotechno, 2002, 20：505-508.

［11］ Zhang T, Cheng T, Wei L, et al. Efficient inhibition of HIV-1 replication by an artificial polycistronic miRNA construct［J］. Virol, 2012, 9：118.

［12］ Brummelkamp TR, Bemards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］. Science, 2002, 296（5567）：550-553.

［13］ Anesti AM, Peeters PJ, Royaux I, et al. Efficient delivery of RNA interference to peripheral neurons in vivo using herpes simplex virus［J］. Nucleic Acids Res, 2008, 36（14）：e86.

［14］ 王鳳雪, 師新川, 溫永俊, 等.高致病性PRRSV Nsp2 基因RNA 干擾對病毒復制的影響［J］.生物技術通報, 2012（5）：132-137.

［15］ Hafner M, Landthaler L, Burger M, et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA binding sites by PAR-CLIP［J］. Cell, 2010, 141（1）：129-141.

［16］ Muppirala UK, Honavar VG, Dobbs D. Predicting RNA-protein interactions using only sequence information［J］. BMC Bioinformatics, 2011, 12：489.

［17］ Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi［J］. Nature Biotech, 2003, 21（6）：635-637.