針對ALK4 基因的TALEN 質粒構建與活性鑒定

曾凡才 顧洪 王軻 周紅

（1.電子科技大學生命科學與技術學院，成都 610054；2.瀘州醫學院生物化學與分子生物學實驗室，瀘州 646000）

TGF-β 超家族包括40 個結構相關成員，它們參與細胞的增殖、分化、粘附、遷移和凋亡等生物學效應［1，2］。這些成員通過與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的兩種膜受體（Ⅰ型和II 型）結合和裝配

發揮作用，一般是配體分子先與II 型受體結合后招募和激活Ⅰ型受體，激活的Ⅰ型受體促使下游信號分子Smads 磷酸化，磷酸化的Smads 從胞質穿梭到核并調節靶基因的轉錄［3，4］。至今，已發現5 種哺乳動物II 型受體（TβR-II、ActR-IIA、ActR-IIB、BMPR-II 和AMHR-II）和7 種I 型受體（Activin receptor-like kinase 1-7，ALK1-7）［5］，其中Activin 的II 型受體（ActRIIA 和ActRIIB）和Ⅰ型受體（ALK4）除與Activins 形成復合物外，還結合GDF1、GDF3、GDF8（myostatin）和Nodal 等家族成員，同時這些配體也激活ALK4 以外的其它受體信號［6］。因此，為了更好地研究這些配體和受體的功能及其相互關系，敲除該信號通路中起關鍵作用的Ⅰ型受體ALK4，對闡明這些復雜的信號通路具有重要意義。

類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）是一種設計簡便、特異性好和毒性低的基因敲除技術。自2010年底應用于基因敲除［7］，目前已在大鼠、小鼠、斑馬魚、酵母、植物和人類細胞等多種生物體中成功應用［8］。TALEN 的設計理念主要來自類轉錄激活因子效應物（Transcription activator-like effector，TALE）和另一基因敲除技術鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）的研究成果。TALE 是主要存在于植物病原體黃單胞菌的一類高度保守的蛋白家族［9］。TALE 的結構主要由N 末端的轉移結構域（TS）、中間DNA 結合結構域、C 末端的核定位信號（NLS）和轉錄激活結構域（AD）組成。TALE 的不同主要在于DNA 結合結構域中重復片段的數量和重復可變的雙殘基（Repeat variable di-residue，RVD）［10］。RVD 是指每個重復單位中+12 和+13 位的氨基酸殘基，它們是實現靶向特異識別DNA 堿基的關鍵位點，隨靶點核苷酸序列的不同而異。2009 年，兩個研究小組分別闡明了TALE 蛋白中RVD 與靶序列堿基的對應關系，最常見的4 種RVD 與堿基的識別關系分別是NI（Asn Ile）-A、NG（Asn Gly）-T、HD（His Asp）-C 和NN（Asn Asn）-G［11，12］。通過TALE 蛋白的氨基酸識別堿基規則，結合鋅指核酸酶的研究成果將TALE 中的轉錄激活結構域（AD）替換成核酸內切酶（Fok Ⅰ）的切割結構域，即構建為TALEN。人們只要將TALEN 的DNA 結合結構域替換為設計的靶點識別域，即可對基因組的特定靶點進行切割，從而實現基因打靶。因此，TALEN 技術的關鍵步驟是TALEN 靶點識別域的構建。本試驗采用改進后的質粒文庫快速直接構建法，只需一步即可完成構建反應。鑒于ALK4 在TGF-β 超家族信號通路中的重要性和信號通路本身的復雜性，本研究詳細介紹用于敲除ALK4 基因的TALEN 質粒構建過程，并進一步鑒定其活性，為建立不同的ALK4 基因敲除細胞系，研究ALK4 基因的功能及其與不同配體之間的關系做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HEK293T 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 試劑和引物 嘌呤霉素購自Sigma 公司；Taq DNA 聚合酶、基因組DNA 提取試劑盒、高純度中抽質粒提取試劑盒、核酸分子量標準購自天根生物有限公司；BamH I、EcoR I 和Hha I 核酸內切酶、小抽質粒提取試劑盒購自寶生物（大連）公司；PCR 產物純化試劑盒購自羅氏公司；卡那霉素購自上海生工；LipofectamineTM2000、DMEM 高糖培養基、Opti-MEM 液體培養基購自Invitrogen 公司；pEGFPN1 質粒由本實驗室保存；TALEN 試劑盒購自上海斯丹賽生物技術有限公司；測序和引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成。本研究所用引物序列如表1 所示。

表1 測序及PCR 擴增所用引物序列

1.2 方法

1.2.1 確定ALK4 基因的靶位點和識別序列 從美國國家生物技術信息中心（NCBI）搜索到ALK4 基因序列。利用TALEN 設計專業網站（https：//tale-nt.cac.cornell.edu/），根據天然TALEs 識別序列的特征和TALEN 靶點的選擇原則［13］，并綜合考慮ALK4的不同剪接異構體序列，最終確定一個作用靶點和TALEN 左右臂識別序列。

1.2.2 根據識別序列構建質粒 采用上海斯丹賽生物技術有限公司的TALEN 試劑盒構建TALEN 質粒。這種方法基于含有TALEN 的DNA 結合重復序列的172 個質粒文庫模塊（圖1），將左、右臂識別序列的最后一位T 去除，以1 個或2 個堿基組合為一個模塊，首個標記為1，最后一個標記為9，依次類推進行標記。每次必須選擇9 個模塊，最后兩個模塊必須為雙模塊。左右臂標記情況見圖1，其中以右臂為例，模塊選擇情況見圖中粗體加下劃線顯示，左臂按照相同方法構建。

圖1 TALEN 左右臂的模塊選擇

每 個 模 塊 取1.5 μL，9 個 模 塊 共13.5 μL。連接反應體系如下：9 個模塊 13.5 μL，左臂或右臂TALEN 骨架載體 1.5 μL，溶液3 2.0 μL，溶液1 1.0 μL，溶液2 1.0 μL，ddH2O 1.0 μL。總體積為20 μL。混勻后在PCR 儀中連接，反應程序如下：37℃ 5 min，16℃ 10 min，15 個 循 環；80℃ 10 min；12℃ 1 min。取出PCR 管并加入1 μL 溶液4 和0.5 μL 溶液5，混勻，37℃孵育1 h，轉化后涂板于含卡那霉素的LB 瓊脂平板，37℃培養過夜。其中，溶液1-5為TALEN 試濟盒中所配。

1.2.3 酶切鑒定 從平板中挑取15 個單克隆菌落，在含卡那霉素的LB 瓊脂平板上劃線培養，同時接種于5 mL 含抗卡那霉素的LB 培養液中，37℃ 250 r/min 培養16 h。用常規質粒小抽試劑盒提取質粒進行酶切：ddH2O 8 μL，10×K Buffer 2 μL，Plasmid 8 μL，BamH I 1 μL，EcoR I 1 μL；總體積20 μL。置于37℃水浴中孵育1 h。在1%瓊脂糖中電泳鑒定，根據酶切后片段大小，選擇符合條件的單克隆測序。

1.2.4 BLAST 比 對 在 網 址http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 中選擇tblastx（使用氨基酸比對），勾選Align two or more sequences（兩序列或更多序列比對），將拼接好的標準核苷酸序列和測序序列分別輸入到上、下文本框中，在BLAST 比對結果中查找比對正確的結果。比對正確的質粒進行反向測序，其中右臂TALEN 表達質粒由于插入片段較長，除正反方向測序外，還在中間設計引物以便測序完整（測序引物見表1）。經BLAST 比對完全正確的單克隆，用中抽質粒提取試劑盒提取質粒。

1.2.5 最低嘌呤霉素濃度的確定 TALEN 質粒帶有抗嘌呤霉素基因，可利用嘌呤霉素篩選轉染陽性細胞，其最低濃度由以下試驗確定：取對數生長期HEK293T 細胞，生長于24 孔板（1×105個/孔），24 h 后分別加入含0、0.5、1、2、3 和4 μg/mL 嘌呤霉素的新鮮篩選培養基，每天更換篩選培養基且監測存活細胞數量，最終確定3-4 d 能殺死所有細胞的最低嘌呤霉素濃度。

1.2.6 轉染試驗 取對數生長期HEK293T 細胞，以1×106個/孔的密度接種于6 孔板中，24 h 后轉染。轉染體系如下：左臂TALEN 質粒 2 μg，右臂TALEN 質 粒 2 μg，pEGFP-N1 質 粒 0.5 μg，Opti-MEM 2×250 μL，LipofectamineTM2000 13.5 μL； 對照組細胞不轉染。24 h 后觀察GFP 表達并替換成含2 μg/mL 嘌呤霉素的篩選培養基。每天更換篩選培養基，觀察到對照細胞全部死亡后，收集試驗組細胞，一半細胞繼續培養，一半細胞用于提取基因組DNA。對照組不進行細胞轉染和不加篩選培養基，直接提取基因組DNA。

1.2.7 PCR 擴增和酶切鑒定 提取HEK293T 細胞基因組DNA，定量后進行PCR 擴增，反應體系為：基因組DNA 2 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、2.5 mmol/L Mg2+4 μL、10 pmol/L ALK4-TALEN-F 和ALK4-TALEN-R 各1 μL、Taq DNA 聚合酶1 μL、10×PCR Buffer 5 μL 和ddH2O 35 μL。擴 增 程 序 為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 min，72℃ 30 s，共30 個循環；72℃ 10 min。取5 μL PCR 產物電泳鑒定，剩余PCR 產物純化后Hha Ⅰ內切酶處理：Hha Ⅰ 1 μL，10×M Buffer 2 μL，PCR 產 物12 μL，ddH2O 5 μL；總體積20 μL。37℃水浴中孵育3 h，3%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統拍照和灰度分析。

2 結果

2.1 ALK4基因的靶位點及TALEN識別序列的確定

根據Bogdanove 和Voytas 描述的TALEN 靶位點選擇原則，在ALK4 基因的TALEN 靶位點左右臂識別序列5'端的前一位（第0 位）堿基都為胸腺嘧啶（T），且靶序列的最后一個堿基（3'端堿基）也都是胸腺嘧啶（T）（對應于最后的0.5 個TALE 重復單元）。左臂識別序列的長度為15 bp，右臂識別序列的長度為18 bp，中間間隔序列的長度為21 bp，間隔序列中有Hha Ⅰ酶切位點，可用于判斷TALEN質粒的活性（圖2）。90%人類基因都有剪切異構體，目前發現至少有3 種可編碼蛋白的ALK4 剪接異構體，本試驗設計的TALEN 質粒可作用于ALK4 基因的3 種剪接異構體的第二外顯子（圖3）。為了避免SNP 影響TALEN 的識別效果，PCR 擴增HEK293T細胞基因組中的靶序列并測序，發現靶序列與設計識別序列完全一致（圖4）。

2.2 TALEN質粒構建及酶切鑒定

構建的左右臂TALEN 質粒均挑取15 個單克隆菌落，抽提質粒進行酶切鑒定（圖5）。TALEN 左臂骨架載體為5 057 bp，其中BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ兩酶切位點之間的片段為803 bp。構建敲除ALK4 基因的TALEN 左臂質粒在BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點之間插入識別重復單位，左臂質粒插入15 bp 的識別序列，除最后一個堿基胸腺嘧啶（T）設計在載體骨架上外，還需插入14 個堿基的識別序列，每個堿基的識別序列由102 bp 核苷酸組成，因此需在骨架載體中插入1 428 bp 的核酸片段。如果構建正確，TALEN 左臂表達質粒經上述雙酶切和電泳分離后應觀察到4 254 bp 和2 231 bp 的兩條片段，據此分析判斷L7 最符合此條件（圖5），用于測序。右臂骨架質粒缺少抗嘌呤霉素基因，只有3 792 bp 大小，雙酶切位點之間的片段也為803 bp，右臂應插入18 個堿基的識別序列，除最后一位T 設計在載體骨架上外，還需插入1 734 bp 的核酸片段。如果構建成功，TALEN 質粒經雙酶切和電泳分離后應觀察到2 989 bp 和2 537 bp 的兩條片段。結果發現R7、R9、R10、R12、R13、R14 和R15 編號質粒均可能構建正確（圖5），將它們測序。

2.3 BLAST比對分析

由于識別4 種堿基的重復單位僅在+12 和+13位的氨基酸殘基不一致，因而不論是拼接的標準序列還是測序序列都是一些相似度很高的序列重復，它們的BLAST 比對結果會有很多，需要從中找到正確的比對結果。根據左臂插入的標準核苷酸序列長度為1 428 bp 和L7 質粒的測序結果，正向測序比對正確的結果應選擇標準核苷酸序列從第1 位，測序序列從第64 位堿基開始進行比對，且兩序列一致性為100%的結果（圖6-A）；反向測序比對正確的結果應選擇標準核苷酸序列是以第1 428 位堿基比對結束，且對應的反向測序序列應在第28 位堿基，兩序列的一致性為100%的結果（圖6-B）。L7 質粒正反向測序比對正確的結果中有327 個核苷酸所編碼的氨基酸重疊且序列完全一致（圖6），說明TALEN左臂質粒L7 構建成功。其它質粒以相同方法分析，結果與L7 質粒類似（圖略）。右臂質粒正向測序結果表明R13 存在一個位點的突變，其它質粒序列正確。選擇其中R9 和R12 進行完整測序，BLAST 比對確認右臂R9 和R12 質粒構建成功。

圖6 L7 質粒序列BLAST 比對結果

2.4 TALEN質粒的活性鑒定

通過共轉染24 h 的pGFP-N1 質粒，熒光顯微鏡觀察到至少60%的轉染效率（圖7）。同時利用嘌呤霉素進行篩選，以最低嘌呤霉素濃度試驗確定的2 μg/mL 嘌呤霉素在加藥3 d 時可致未轉染細胞全部死亡，而轉染TALEN 質粒的HEK293T 細胞還剩余至少50%，一定程度反映了轉染效率。用ALK4 基因靶序列兩端設計的PCR 引物擴增HEK293T 細胞基因組DNA，電泳結果表明無論是否轉染TALEN 質粒都可獲得與預期371 bp 一致的特異帶（圖8）。此PCR 產物純化后經Hha Ⅰ內切酶酶切，未轉染組的PCR 產物完全被切開，生成與預期297 bp 和74 bp一致的兩條帶，而轉染TALEN 質粒的一部分PCR產物未被切開，灰度分析大約占總條帶的10%，說明其Hha Ⅰ內切酶位點已發生突變，部分HEK293T細胞的ALK4 基因被敲除（圖9）。此外，L7+R9 和L7+R12 兩個質粒組合因為識別序列一樣，作用于靶點的活性也基本相同（圖9）。

3 討論

本研究綜合考慮靶點選擇原則和ALK4 剪接異構體的共同序列，最終將靶點確定在ALK4 基因的第二外顯子，確保如果ALK4 基因被敲除后，ALK4功能不會被其剪接異構體所補償。靶序列中間有一Hha Ⅰ酶切位點以方便判斷質粒活性［14］。如果識別序列中只要有一個堿基出現錯配就有可能較大幅度地降低TALEN 的活性。因此，通過PCR 擴增HEK293T 細胞基因組中的靶序列并測序，比對后發現該段序列在HEK293T 細胞基因組中不存在SNP現象。通過一步法構建TALEN 質粒，用酶切鑒定和測序，最后通過BLAST 序列比對成功獲得敲除ALK4 基因的TALEN 質粒，并用酶切鑒定的方法證明在HEK293T 細胞中有一定活性。

與其它基因敲除技術相比，TALEN 簡便實用，理論上可作用于基因組中的任何位點［15］。目前TALEN 的構建方法包括DNA 序列直接合成、Golden Gate 克隆、PCR 與Golden Gate 克隆結合、Toolbox組裝、基于同尾酶的單元組裝、FLASH 組裝和LIC組裝等，它們各有特點［14，16-18］。例如，北京大學張博［19］課題組開發的基于同尾酶的單元組裝法已在斑馬魚的基因敲除中取得很好的效果，該方法費用較低，但步驟較多。如果構建TALEN 較多，積累了較多不同重復單元的模塊后，效率也比較高。本研究采用改進后的質粒文庫快速直接構建，可通過一步連接反應構建識別序列為12-19 bp 之間任意長度的TALEN 質粒。一般挑選15 個克隆即可篩選到構建正確的質粒，而且在TALEN 載體質粒上設計有嘌呤霉素抗性基因，可用嘌呤霉素提高篩選效率。

TGF-β 超家族信號通路中存在一個配體作用于多個受體，一個受體也可接受多個配體信號這一復雜現象。為揭示這種復雜的關系，敲除其中的重要基因是一個不錯的選擇。ALK4 作為多種TGF-β 超家族成員的受體分子，在這一復雜的關系中處于關鍵位置，但早期研究表明敲除ALK4 基因導致胚胎死亡［20］，因此限制了對ALK4 基因功能的研究。最近發展起來的TALEN 基因敲除技術方便快捷，希望能利用該技術建立敲除ALK4 基因的不同細胞系，以研究ALK4 的功能。

本研究成功構建了敲除ALK4 基因的TALEN 質粒，并證明在HEK293T 細胞中有一定的活性。雖然通過觀察共轉染的GFP 表達以及嘌呤霉素的篩選都證明TALEN 質粒的轉染效率較高，但TALEN的切割效率可能并不高，導致發生基因組突變的HEK293T 細胞并不多。這說明TALEN 技術雖在多個物種已取得成功，但不能保證每個位點都有高活性。這是因為TALEN 這一新興技術還沒有完全被認識，但其有效性是肯定的。我們下一步將通過大量篩選細胞得到敲除ALK4 基因的細胞系或者在同一位點設計多條左右臂TALEN 質粒，組合使用這些質粒以篩選到更高活性的TALEN 質粒。

4 結論

本研究成功構建了敲除ALK4 基因的TALEN質粒，并采用脂質體法導入HEK293T 細胞，且TALEN 質粒有一定的活性。

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