胃癌組織中PIK3CA基因熱點突變篩查及臨床意義

郝蘭香，潘 超*，蔡建春

(廈門大學 附屬中山醫院 1.病理科； 2.胃腸外科， 福建 廈門 361004)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位a(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha，PIK3CA)是目前3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)家族成員中發現的唯一可以發生體細胞突變而致癌的基因，約30%的人類實體瘤存在PIK3CA基因的突變[1]。胃癌作為中國最常見的惡性實體瘤之一，其發病率及病死率較高，其中基因突變在胃癌的發生、發展過程中起著非常重要的作用。鑒于相當一部分單核苷酸多態性的頻率在不同民族、人群有顯著差異，中國人群胃癌組織中是否存在PIK3CA基因突變？其突變頻率與突變模式如何？目前國內未見大規模病例研究。本研究旨在檢測中國人群胃癌組織中PIK3CA基因突變情況，探討其突變與胃癌臨床病理特征之間的關系，為胃癌的臨床治療、預后判斷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集廈門大學附屬中山醫院2007至2010年間行胃癌根治手術切除并經病理證實為胃癌的標本400例，患者均為中國人，年齡20～80歲。所獲標本均征得患者知情同意。

1.2 主要試劑

石蠟組織DNA提取試劑盒(北京信然達科技有限公司)；人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥公司)。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA抽提：對入選病例石蠟包埋組織樣本行5 μm厚切片，每例10片，切片置于4 ℃冰箱保存。按照石蠟組織DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，使用紫外分光光度計對DNA進行定量。

1.3.2 熒光PCR法檢測胃癌PIK3CA基因突變：人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒基于實時PCR平臺結合了特異引物和雙環探針兩種技術，檢測DNA樣品中含有的突變基因。利用特異引物對突變靶序列進行高精準PCR擴增放大。與此同時，利用雙環探針對擴增產物進行檢測，結合特別的PCR反應程序和高特異Taq酶的使用，在實時PCR平臺上實現對樣品DNA中突變的檢測，以達到對稀有突變檢測的高特異性和高靈敏度，即高的選擇能力。具體操作按試劑盒說明書進行。

突變結果確定：首先確定樣品各個反應管各自的突變Ct值，然后確定該樣品的外控Ct值，根據不同的突變Ct值，把樣品檢測結果分為陰性、弱陽性及強陽性(表1)。

當樣品突變Ct值大于或等于陰性臨界值時，則該樣品為陰性。當樣品突變Ct值小于陰性臨界值時，進行下列判斷：

1)當某個反應管的突變Ct值小于陽性臨界值時，則該樣品為該反應管對應的突變陽性，即強陽。

2)當反應管的突變Ct值大于或等于陽性臨界值時，則計算該反應管的ΔCt Cut-off值。若反應管的ΔCt值小于相對應的ΔCt Cut-off值，則該樣品也為該反應管對應的突變陽性，即弱陽。反之，則為陰性。

1.3.3 基因突變類型分析：將篩查出的陽性病例PCR產物送往生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1. 4 統計學分析

分析PIK3CA基因突變與胃癌臨床病理特征如腫瘤大小、組織學分級、淋巴結狀態、患者年齡、預后(3年中位生存期)之間的關系采用χ2檢驗。統計處理采用SPSS18.0統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 胃癌PIK3CA基因突變檢測結果

2.1.1 胃癌PIK3CA基因突變陽性病例篩選結果(熒光PCR)：400例胃癌標本中發現有30例發生了PIK3CA基因突變，突變率為7.5%，而作為對照的400例癌旁組織無1例發生基因突變，突變率為0。陽性病例熒光PCR結果截圖如下(圖1)。

表1 樣品檢測結果判定Table 1 Determination of sample test results

A.H1047R positive; B.E545K positive; C.H1047L positive; D.E542K positive 圖1 胃癌PIK3CA檢測陽性截圖(熒光PCR) Fig 1 PIK3CA mutation(fluorescence PCR)

2.1.2 胃癌PIK3CA基因突變陽性病例測序結果(圖2)和PIK3CA基因突變類型(表2)：30例陽性病例其突變位點主要集中在第9外顯子(E542K，10例，占33%；E545K，6例，占20%)和第20外顯子(H1047R，11例，占37%；H1047L，3例，占10%)，未檢測到第9外顯子E545D位點突變，此點與國外文獻報道不同。

表2 中國人胃癌PIK3CA基因突變類型

2.2 PIK3CA基因突變與胃癌臨床病理特征之間的關系

PIK3CA基因突變在腫瘤大小、組織學分級、淋巴結狀態及患者年齡等組間比較無明顯差異，而在預后組間有顯著性差異(P<0.05)(表3)。

表3 PIK3CA基因突變與臨床病理參數之間的關系

*P<0.05 compared with survival period ≤3 years.

A.H1047R; B.E545K; C.H1047L; D.E542K圖2 胃癌中PIK3CA基因突變的測序結果Fig 2 PIK3CA mutation in gastric cancer

3 討論

PI3K是脂質激酶，其介導的信號傳導通路(PI3K/AKT信號通路)控制著眾多在腫瘤發生發展中至關重要的細胞生物學過程，與人類多種惡性腫瘤的發生、發展和轉歸密切相關。PIK3CA是Ⅰ型PI3K的P110催化亞單位，即PI3K p110a的編碼基因，定位于染色體3q26.3，長34kb，含20個外顯子，是目前PI3K家族成員中發現的唯一可發生體細胞突變而致癌的基因。PIK3CA基因突變可導致PI3K p110a過度表達，引發PI3K/AKT信號通路持續活化，進而加速細胞周期、抑制細胞凋亡、增強化療拮抗，以促進腫瘤發生發展[1]。

文獻報道PIK3CA在包括結腸癌[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4]等多種實體瘤中呈高頻突變,除少數突變發生在第l外顯子(P85a)外[5]，80%PIK3CA基因突變都集中在第9(螺旋區，包括E542K、E545K、E545D等突變類型)和第20(激酶區，包括H1047R，H1047L等突變類型)外顯子的特異性位點上[6]。它的這種非隨機高頻突變也顯示了其在腫瘤發生中的意義。

胃癌作為一種基因病，與多種癌基因的激活有關，在與胃癌發生發展密切相關的眾多癌基因中，PIK3CA突變頻率較高，其突變率可達14.3%[7]。實驗結果顯示，中國人群胃癌組織中也存在PIK3CA基因突變，但其突變頻率(7.5%)和熱點突變模式(主要位于E542K和H1047R位點，小部分在E545K和H1047L位點，無E545D位點突變)與國外文獻報道存在差異，這可能與一些影響因素有關，如種族和地理差異、樣本來源、儲存與分離DNA的方法等。胃癌組織中PIK3CA基因突變明顯影響著腫瘤的預后及治療。PIK3CA基因突變患者較未發生PIK3CA基因突變患者之間，生存期存在顯著差異，預后相對較差。提示，PIK3CA基因突變對胃癌預后判斷具臨床意義。此外，研究表明[8- 9]，靶向藥物赫賽汀應用于HER- 2陽性胃癌患者，可明顯提高患者的生存期，但存在PIK3CA基因突變患者卻療效不佳，究其原因是PIK3CA基因突變會導致腫瘤對靶向藥物產生耐藥。顯示，PIK3CA基因突變對于靶向藥物療效預測具有重要意義。PIK3CA基因突變引發PI3K/AKT信號通路持續活化，通過多個環節促進腫瘤發生發展，PIK3CA成為腫瘤調控的一個關鍵點，將PIK3CA作為腫瘤治療的一個新的分子靶點具潛在臨床價值。

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