石決明提取液對晶狀體抗氧化能力的影響

崔麗金 徐國興

白內障是中國乃至全世界的首位致盲眼病，氧化損傷在白內障的發生、發展中起重要作用。石決明性味咸而微寒，入肝、肺、腎三經，為清肝明目、平肝潛陽之藥，可用治目赤翳障、青盲雀目、怕光羞明、視物昏花等各種虛實眼科疾患［1］。石決明自古以來即為清肝明目、退翳除障之藥，已有石決明的復方制劑用于防治白內障的實驗室研究［2，3］。本研究通過體外培養氧化損傷的人晶體上皮細胞探討其抗氧化損傷的作用。

材料與方法

1.材料:(1)實驗細胞:人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECsSRA01/04)(上海復蒙基因生物科技有限公司)。(2)石決明中藥水提取液:福建醫科大學眼科研究院提供。(3)試劑:DMEM/HIGH GLUCOSE(1 ×)、胎牛血清(美國Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(美國Gibco 公司);3%H2O2(南昌白云藥業有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測試盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒和Bradford 蛋白質定量試劑(自南京建成生物工程研究所);CCK-8、PMSF(100mmol/L)、Western 及IP 細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)。(4)儀器:BIO-RAD 550 型酶標儀(美國)，722G 可見分光光度計，DT5 -3 型臺式低速自動平衡離心機(北京)，臺式高速冷凍離心機(德國)，AIR -TECH BCM - 1000A 型生物潔凈工作臺(蘇州)，THERMO FORMA 311 型水套式CO2培養箱(美國)，OLYMPUS 1 ×70熒光倒置相差顯微鏡(日本)，數顯恒溫水浴鍋，SHE-Ⅲ型循環真空泵。

2.方法:(1)實驗分組:人晶體上皮細胞(HLECs)加入含10%胎牛血清的DMEM-HG 培養基中，置于37℃、100%濕度和5% CO2的培養箱中培養。細胞生長至接近瓶底約80%時及時凍存或傳代，按1∶3 ～1∶4 傳代。實驗分組:①空白對照組:HLECs + DMEM 維持液;②陽性對照組:HLECs +DMEM維持液+ 0. 15mmol/L H2O2;③石決明實驗組:HLECs +DMEM 維持液+0.15mmol/L H2O2+不同濃度的石決明提取液(分別為0.001%、0.01%、0.1%、0.3%)。(2)CCK -8 法檢測不同濃度石決明提取物對HLECs 增殖能力的影響:消化并收集生長狀態良好、呈對數生長期的HLECs，接種于96 孔培養板中，細胞密度為8 ×104個/毫升，置于37℃、100%濕度和5% CO2的培養箱中培養1 天，棄去培養液，按照上述實驗分組，需H2O2干預的組別用H2O2干預3h，同時加不同濃度的石決明與細胞共培養1、3 和5 天后除去舊的培養液，各組培養板分別加入10μl CCK-8 和90μl 培養基的混合液，置于培養箱中繼續孵育1h 后于全自動酶標儀上450nm 波長比色測定，測定各組的吸光值，即OD 值。細胞活力(%)=(實驗組平均OD 值-空白組平均OD 值)/(正常組平均OD 值-空白組平均OD 值)×100%。(3)檢測石決明提取物對HLECs中SOD、GSH、MDA 水平的影響:消化并收集生長狀態良好、呈對數生長期的HLECs，接種于6 孔培養板中，細胞培養及實驗分組同上。按實驗分組加H2O2干預3h，同時加濃度為0.1%的石決明提取液與細胞共培養5 天后除去舊的培養液，各組各自消化4℃低溫離心，加入300μl 冷的生理鹽水，在冰浴中勻漿3min 左右，按說明書的要求用分光光度計檢測勻漿液中SOD 活力、GSH 和MDA 含量。

3.統計學方法:應用SPSS 17.0 統計軟件分析，用均數±標準差(±s)表示，單因素方差分析進行樣本均數間的多重比較，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.不同濃度及時間點石決明提取液對HLECs 增殖能力的影響:據不同時間點各實驗組HLECs 活力存在變化，且各組間比較差異具有統計學意義(1 天時，F=23922.421，P ＜0.01;3 天時，F=120605.864，P＜0.01;5 天時，F=150939.452，P ＜0.01)。從而得出圖1，可見H2O2使細胞的活力降低，石決明提取液對H2O2引起的晶狀體上皮細胞氧化損傷具有保護作用，提高其活力，且在一定的時間和濃度范圍內具有濃度依賴性。當石決明提取液濃度升高到0.1%，作用時間維持達到3 天時，細胞的活力達到最高。

2.石決明提取液對HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平的影響:應用化學比色法檢測空白對照組、陽性對照組和0. 1% 石決明實驗組HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平顯示，SOD、GSH 在空白對照組中最高，陽性對照組中的活力最低，3 組間的差異具有統計學意義(P ＜0.01)。MDA 在陽性對照組中的含量最高，0.1%石決明實驗組次之，空白對照組最低，3 組間差異具有統計學意義(P ＜0.01，表1)。

圖1 不同濃度及時間點石決明提取液對HLECs 活力的影響

表1 石決明提取液對氧化損傷的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影響(±s，n=8)

表1 石決明提取液對氧化損傷的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影響(±s，n=8)

組間SOD 活力、GSH 含量、MDA 含量比較，P ＜0.01

組別SOD 活力(U/mg)GSH 含量(mg/g)MDA 含量(nmol/mg)212.14 ±2.09 25.37 ±0.74 10.89 ±0.40陽性對照組 158.05 ±2.12 15.05 ±0.61 18.11 ±0.27石決明實驗組空白對照組188.64 ±3.02 21.05 ±0.73 14.16 ±0.39

討 論

氧自由基損傷是老年性白內障首位危險因素，晶狀體內自由基主要是超氧陰離子自由基、羥自由基、H2O2，其中羥自由基損害最嚴重，但超氧陰離子自由基、羥自由基半衰期短，而H2O2相對較穩定，且可以從一處轉移到另一處，在SOD、過渡金屬(Fe2+、Cu+)存在下發生歧化。本實驗應用H2O2與人晶狀體上皮細胞共培養造成體外培養晶狀體上皮細胞氧化損傷模型［4，5］。各種理化因素均可通過不同途徑導致晶狀體自由基產生，如自由基產生過多或清除障礙，均可導致自由基聚積。自由基最先損害的靶目標是晶狀體上皮細胞，其次是晶狀體纖維。晶狀體上皮細胞是抗氧化損傷的活性中心，通過兩個途徑發揮抗氧化的作用。第1 個途徑是以還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、抗壞血酸和維生素E 等抗氧化劑為代表的清除自由基機制［6］。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，分子中半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團，巰基具有還原性，作為體內重要還原劑保護蛋白質或酶分子中的巰基免遭氧化，使蛋白質或酶處于活性狀態。在哺乳動物體內，晶狀體是富含GSH 的組織之一。抗氧化酶系是晶狀體另一個抗氧化屏障，主要是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和SOD。生理狀態下晶狀體中氧化和抗氧化二者處于動態平衡，但當機體氧化物質產生過多或清除這些物質的能力下降時，晶狀體將受到損傷，表現在GSH、SOD 含量大幅度下降［7］。

實驗中從CCK -8 檢測各實驗分組不同時間點細胞增殖情況的統計數據得出的圖1 可見:H2O2使細胞的增殖能力降低，石決明提取液對H2O2引起的晶狀體上皮細胞氧化損傷具有保護作用，提高其增殖能力，恢復細胞活力，且在一定的時間和濃度范圍內具有濃度依賴性。當石決明提取液濃度升高到0.1%，作用時間維持達到3 天時，細胞的增殖能力最高，活力達最佳。

本實驗研究結果顯示相對于空白對照組，陽性對照組中晶狀體上皮細胞內的SOD 活力和GSH 含量降低，提示其抗氧化系統活力減弱，說明H2O2對晶狀體上皮細胞具有氧化損傷作用，石決明組使晶狀體上皮細胞中降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，說明石決明對氧化損傷的晶狀體上皮細胞中抗氧化系統有保護作用，這與石決明對白內障大鼠晶體中SOD、GSH 及GSH -PX 的影響結果相一致［8］。相較于空白對照組，陽性對照組中晶狀體上皮細胞中MDA 明顯增多，提示H2O2使晶體上皮細胞受到氧化損傷，使晶體細胞內脂質過氧化產物堆積，石決明組中氧化損傷的晶體細胞內MDA 增多有所減輕，降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，說明石決明可能是通過保護晶狀體細胞內的抗氧化系統，促進上皮細胞清除自由基，從而減輕細胞的氧化損傷，使MDA 增多有減少，減輕脂質過氧化產物對細胞膜及蛋白質等的攻擊，使晶狀體上皮細胞避免氧化損傷，從而可能具有潛在的抗氧化作用。據相關的石決明炮制工藝的研究提示，石決明提取液的主要成分為多種離子，包括Ca、Fe、Zn、Cu、Mn 等［9］。有研究表明Fe、Mn、Zn 等離子在不同時間點對蚯蚓體內外的抗氧化酶有不同程度的激活或抑制作用［10］。石決明提取液可能是通過其內的離子對酶的活性產生激活，從而進一步在一定程度上保護細胞免受氧化損傷，提高其活力。

1 溫暖榮.石決明散在眼科應用舉隅［J］.中西醫結合眼科志，1997，15(1):59

2 徐國興，林媛，王婷婷，等.石決明藥理研究及眼科應用進展［J］.國際眼科雜志，2009，9(12):2389 -2390

3 劉靜霞，張曉冬，呂瑞民，等. 決明退障丸對亞硒酸鈉性白內障大鼠脂質過氧化的影響［J］. 中國中醫藥科技，2005，12(3):143 -145

4 Gajjar D，Patel D，Alapure B，et al. Rapid action of oestradiol against hydrogen peroxide induced oxidative stress in cataractous lens epithelium:an in vitro study［J］. Eye(Lond)，2009，23(6):1456 -1463

5 L?fgren S，Fernando MR，Xing KY，et al.Effect of thioltransferase (glutaredoxin)deletion on cellular sensitivity to oxidative stress and cell proliferation in lens epithelial cells of thioltransferase knockout mouse［J］. Invest Opthalmol Vis Sci，2008，49(10):4497 -4505

6 Reddan JR，Giblin FJ，Kadry R，et al. Protection from oxidative insult in glutathione depleted lens epithelial cells［J］. Exp Eye Res，1999，(68):117 -127

7 張偉，陳翠真.牛磺酸對亞硒酸鈉性白內障抑制作用的實驗研究［J］.中華眼科雜志，1998，34:208 -210

8 祁磊，林媛，徐國興，等. 石決明對大鼠白內障晶狀體中SOD 和GSH 及GSH-PX 的影響［J］.國際眼科雜志，2011，12(11):2085-2087

9 王文凱，彭小平.石決明炮制研究［J］.中成藥，2004，26(5):377 -379

10 Naqai N，Ito Y，Takeuchi N. Correlation between hyper -sensitivity to hydro- gen peroxide and low defense against Ca2+influx in cataractogenic lens of ihara cataract rats［J］. Biol Pharm Bull，2011，34(7):1005 -1010