內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶與銀屑病研究進(jìn)展

馮燕艷 普雄明

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶1(ERAP1)及其異構(gòu)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶2(ERAP2)都屬于鋅指金屬基質(zhì)肽酶M1 家族中的“縮宮素酶亞家族”，在人類細(xì)胞均由IFN -γ 和TNF-α 誘導(dǎo)表達(dá)［1，2］。參與許多生化過(guò)程:在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與內(nèi)源性抗原肽的修飾及遞呈，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與內(nèi)源性抗原肽修飾的關(guān)鍵酶［3］。ERAP1 還參與細(xì)胞因子受體(如促進(jìn)腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，IL-6α 受體和IL-1β 受體胞外結(jié)構(gòu)域)的脫落，使之成為可溶性受體。基于多功能的特性，ERAP1 又被稱為:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的氨肽酶抗原處理(ERAAP)，脂肪細(xì)胞源性的亮氨酸minopeptidase(A-LAP)，氨肽酶調(diào)節(jié)TNFR1 脫落(ARTS -1)和嘌呤霉素不敏感的的亮氨酸氨肽酶(PILS -AP)，而ERAP2 特定被稱為白細(xì)胞衍生的的精氨酸氨肽酶(LRAP)。

一、ERAPs 結(jié)構(gòu)及功能

1. ERAP1 和ERAP2 基因:ERAP1 基因位于5q15，序列全長(zhǎng)約47kb，共有20 個(gè)外顯子。ERAP2基因位于染色體5q15 上ERAP1 和亮氨酰-胱氨酸肽酶基因之間，包含19 個(gè)外顯子，約43kb。ERAP1基因和ERAP2 基因結(jié)構(gòu)相似，6 號(hào)外顯子都包括特征性的鋅蛋白結(jié)合基序HEXXH(X)18E 和決定gluzincin 氨基轉(zhuǎn)肽酶活性的GAMEN 基序，以及7 號(hào)外顯子的谷氨酸。ERAP1 基因有2 個(gè)的異構(gòu)體(較長(zhǎng)的ERAP1 -a 和較短的ERAP1 -b)，其區(qū)別主要在20號(hào)外顯子的不同，在人體細(xì)胞中ERAP1 -bmRNA 的含量較ERAP1 -a 更多［4］。ERAP2 基因的19 號(hào)外顯子中包含47 個(gè)氨基酸的編碼序列，終止密碼子和3'UTR 區(qū)域;10 號(hào)外顯子5'的剪接位點(diǎn)內(nèi)的SNP rs2248374 不同(A 到G)可形成不同變種，主要等位基因A 的雜合子AG 和純合子AA 都表達(dá)ERAP2 蛋白，而最小等位基因G 的純合子不能表達(dá)ERAP2 蛋白，影響MHC-Ⅰ類抗原遞呈［5］。

ERAP1 基因具有高度多態(tài)性及強(qiáng)連鎖不平衡性。近期的GWAS 研究證實(shí)了多個(gè)ERAP1 SNPs 變異與高血壓和多種的人類疾病有關(guān)。推測(cè)這些變異導(dǎo)致的生物學(xué)功能的潛在影響可能與ERAP1 結(jié)構(gòu)的位置有關(guān):rs2287987 (M349V)位于活性位置，rs17482078(R725Q)和rs27044 (Q730E)位于C 端空腔的內(nèi)部表面可能影響底物序列或特異性長(zhǎng)度。Rs26653 (R127P)，rs30187(K528R)和rs10050860(D575N)位于連接區(qū)域能夠通過(guò)依次改變開(kāi)放和關(guān)閉結(jié)構(gòu)而間接影響酶的特異性和活性。Rs30187 和rs27044 也在人群中被證實(shí)與許多疾病有關(guān)。這些多態(tài)性可以引起氨肽酶對(duì)合成肽底物和幾個(gè)抗原前體肽的活性明顯減低。ERAP2 基因也具有多態(tài)性，rs17408150(N392K)位于催化位點(diǎn)非常近，并與一些重要的催化殘基相互作用［6］。

2.ERAPs 蛋白結(jié)構(gòu):ERAP1 蛋白有3 種晶體結(jié)構(gòu)，都包括1 個(gè)大的開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，形成內(nèi)部較大的空腔用以容納多種較長(zhǎng)的抗原肽前體，在催化和調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合的長(zhǎng)肽底物，可以誘導(dǎo)晶體構(gòu)象重排，導(dǎo)致酶的激活或進(jìn)行有效的微調(diào)［7］。ERAP2 的晶體結(jié)構(gòu)與ERAP1 的主要結(jié)構(gòu)有49%的相似［8］。其晶體結(jié)構(gòu)的不同決定兩種酶不同的生物學(xué)作用。關(guān)鍵的變化體現(xiàn)在S1 口袋，ERAP1 蛋白的Q181 和ERAP2 的D198導(dǎo)致了兩種酶在MHCⅠ類抗原遞呈活性和底物特異性的差異。ERAP1 優(yōu)先水解疏水殘基(亮氨酸和異亮氨酸)，而ERAP2 顯示偏好堿性氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)。將ERAP1 的Q181 替換為D，可導(dǎo)致底物特異性明顯改變，因?yàn)镼181D ERAP1 更優(yōu)先選擇堿性氨基酸［9］。

3.ERAPs 在MHCⅠ抗原肽遞呈中的作用:在細(xì)胞質(zhì)中，蛋白水解酶將內(nèi)源性蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生具有抗原位點(diǎn)的肽段，被抗原遞呈蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TAP1和TAP2)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并由ERAP 水解到能結(jié)合到MHCⅠ類分子所需要的長(zhǎng)度，并將其遞呈于細(xì)胞表面供CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷(NK)識(shí)別。而對(duì)8個(gè)氨基酸殘基的抗原肽則無(wú)作用。由于TAP1 和TAP2 傳遞的抗原肽往往超過(guò)MHCI 類分子結(jié)合的合適的長(zhǎng)度，ERAPs 對(duì)抗原肽的修剪在其遞呈中很關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)ERAP1 的缺失或抑制會(huì)擾亂MHCⅠ類抗原肽的遞呈，質(zhì)譜分析顯示ERAP1 缺乏小鼠MHCⅠ類分子遞呈的內(nèi)源性肽長(zhǎng)度明顯增加，證實(shí)了ER 肽修剪決定了MHCⅠ類分子遞呈的抗原肽的成分和結(jié)構(gòu)［10］。

腫瘤細(xì)胞ERAP1 表達(dá)的下調(diào)或缺失，與腫瘤細(xì)胞膜表面MHCⅠ類分子表達(dá)下調(diào)或丟失存在顯著關(guān)聯(lián)性，可能通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原肽的加工處理與遞呈功能，致使機(jī)體免疫應(yīng)答降低。部分腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)ERAP1，但酶活性明顯下降，推測(cè)可能與其異常的翻譯后修飾有關(guān)，而ERAPl 的高表達(dá)可使腫瘤內(nèi)的血管密度減少，在抑制腫瘤血管生成方面起著重要的作用。

4.ERAP1 和細(xì)胞脫落:ERAP1 參與包括腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，IL -6Rα 和IL -1RⅡ等細(xì)胞因子表面受體裂解過(guò)程。ERAP1 可與人內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面的TNFR1 區(qū)域結(jié)合促進(jìn)其受體的脫落，免疫印記法顯示了ERAP1 和膜相關(guān)性TNFRⅠ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制ERAP1 可以減少TNFRI 的脫落，ERAP1 高表達(dá)的的細(xì)胞培養(yǎng)的上清液顯示了可溶解的TNFR1 水平。盡管ERAP1 表達(dá)的變化與TNFR1脫落呈正比，但其并不直接催化TNFR1 胞外區(qū)的脫落，而是輔助其他金屬蛋白酶在TNFR1 脫落中起作用。ERAP1 不能作為真正意義上的裂解酶，ERAP1必須與核蛋白(nucleobindin 2)和RBMX (RNA -結(jié)合基序基因，43kDa 的異質(zhì)性胞核核糖核蛋白)結(jié)合成一復(fù)合體，調(diào)節(jié)TNFRI 外來(lái)體狀囊泡的結(jié)構(gòu)的釋放和IL-1β 介導(dǎo)的可誘導(dǎo)的TNFR1 的胞外區(qū)蛋白裂解。相似的，ERAP1 也可促進(jìn)IL-6R 和IL-1RⅡ的裂解，ERAP1 通過(guò)調(diào)節(jié)3 種不同類型細(xì)胞因子受體超家族的脫落，在調(diào)節(jié)天然免疫和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

二、ERAPs 與銀屑病相關(guān)性研究

銀屑病是一種常見(jiàn)的表皮過(guò)度增生的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，屬于遺傳和環(huán)境因素共同作用的多因素疾病，本病有種族差異，白種人發(fā)病率較高，可達(dá)2% ～5%，非洲及亞洲群體的發(fā)病率較低［11］。由種族因素影響銀屑病的發(fā)病差異的具體作用機(jī)制尚不是很清楚，但不同種族間的差異主要還是體現(xiàn)在遺傳素質(zhì)的不同，因此，一定程度上可以認(rèn)為遺傳異質(zhì)性是影響銀屑病發(fā)病率的一個(gè)重要因素［12］。GWAS 研究通過(guò)大樣本量證實(shí)了與多種疾病相關(guān)的候選易感基因和遺傳位點(diǎn)。近期GWAS 報(bào)道進(jìn)行深入分析得出ERAPs SNP 與一些自身免疫性疾病相關(guān)并在隨后的病例對(duì)照研究中得以驗(yàn)證。

銀屑病是典型的常見(jiàn)的包括天然免疫系統(tǒng)和復(fù)雜的遺傳背景的炎癥性皮膚病，可能合并關(guān)節(jié)炎。其影響到全世界人口的3%，有相當(dāng)大的種族差異。以前的連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析研究鑒定MHC 區(qū)域的HLA-C 是最可能的候選基因。GWAS 除HLA -C外，還鑒定出一些非MHC 位點(diǎn)，與CD8+T 淋巴細(xì)胞相關(guān)的ERAP1 在多個(gè)種族不同人群中均顯示與銀屑病發(fā)病相關(guān)［13，14］。

Sun 等［13］在前期GWAS 研究基礎(chǔ)上，開(kāi)展多中心，大樣本量的國(guó)際合作(中國(guó):21231 例;歐美:7481例)，合并了中國(guó)漢族人群樣本對(duì)ERAP1 基因(rs151823，P=9.32 ×10-9，OR =0.89)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，分析結(jié)果顯示該位點(diǎn)等位基因頻率在病例組較對(duì)照組低，之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在新疆維吾爾族人群中研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)漢族人群，該位點(diǎn)等位基因頻率在病例組較對(duì)照組更低(P =2.92 ×10-5，OR = 0.69)，而該位點(diǎn)在德國(guó)、美國(guó)核心家系和散發(fā)病例中均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。隨后崔婧等［15］選取7717 例銀屑病患者和11831 例正常對(duì)照的ERAP1基因多態(tài)性rs151823 位點(diǎn)的基因分型資料，采用χ2檢驗(yàn)比較各組間基因型和等位基因頻率的分布差異，結(jié)果顯示ERAP1 基因多態(tài)性rs151823 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布差異在病例組和對(duì)照組、早發(fā)患者和晚發(fā)患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在家族史陽(yáng)性患者和家族史陰性患者、急性點(diǎn)滴型患者和慢性斑塊型患者間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

牛津大學(xué)的Strange 等［14］在對(duì)合并后病例∶對(duì)照=6523∶10639 的歐洲人群銀屑病GWASs 研究中，亦發(fā)現(xiàn)ERAP1 和銀屑病的相關(guān)性(rs27524，P combind=2.56 × 10-11)。而且，通過(guò)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，該基因和HLA -C 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有交互作用。ERAP1 的變異只影響那些攜帶HLA -C 危險(xiǎn)等位基因的人群對(duì)銀屑病的易感性。Yang 等［16］在379 例漢族銀屑病，595 例關(guān)節(jié)形銀屑病及1181 例健康對(duì)照組通過(guò)MassARRAY 平臺(tái)進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，rs27524 在尋常型銀屑病組及關(guān)節(jié)型銀屑病組均顯示出差異(P ＜0.05)。

Lysell 等［17］在銀屑病人群中驗(yàn)證了MHC 和既往曾報(bào)道過(guò)的與AS 相關(guān)的ERAP1 的SNP(rs26653，rs27524)、與硬皮病相關(guān)的SNP(rs30187)。在將年齡細(xì)化分層分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，當(dāng)發(fā)病年齡在10 ～20 組，rs26653 與銀屑病相關(guān)性最強(qiáng)(OR =1.59，P=0.000)，而在低于10 歲的患病組則無(wú)明顯相關(guān)性。而且在進(jìn)行分析時(shí)也未發(fā)現(xiàn)ERAP1 rs26653 和HLA - C*0602 的相互作用。Bergboer等［18］在小樣本荷蘭銀屑病患者中發(fā)現(xiàn)，ERAP1 與幼年發(fā)病的銀屑病相關(guān)(rs27524，P =0.042)。但也有相反結(jié)果，Hinks 等［19］在發(fā)現(xiàn)ERAP1 與關(guān)節(jié)痛相關(guān)的肌腱骨止點(diǎn)炎癥、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，而IL23 基因則與幼年發(fā)生的關(guān)節(jié)性銀屑病相關(guān)。提示了這些疾病在發(fā)病機(jī)制上的不同。Julià 等［20］也在單純皮膚損害的銀屑病患者人群中發(fā)現(xiàn)ERAP1 和HLA-C 的交互作用。ERAP1 基因的不同變異可導(dǎo)致遞呈給MHCⅠ類分子的抗原肽的種類發(fā)生變化，可導(dǎo)致復(fù)雜表型疾病(如銀屑病)的不同臨床表型。

大多數(shù)與多因素疾病相關(guān)的SNP 僅僅能改變疾病發(fā)病的歸因危險(xiǎn)度。大多數(shù)鑒定的SNP 可能位于基因組的非編碼區(qū)，因而他們?cè)诩膊“l(fā)展中的的致病作用可能來(lái)自于蛋白水平的剪接作用或在特定細(xì)胞類型上的轉(zhuǎn)錄作用。在特定疾病中，ERAP SNPs 與MHCⅠ類分子相關(guān)，基因-基因間的交互作用支持ERAPs 在自身免疫性疾病發(fā)病中起作用。然而，ERAP 相關(guān)SNPS 如何影響疾病發(fā)病機(jī)制(包括診斷和相應(yīng)檢查方面的價(jià)值)目前仍不知曉。在自身免疫性疾病研究中，選擇合適的生物系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上廣泛地研究來(lái)展示ERAPs SNP 位點(diǎn)與疾病的易感性等方面的作用是未來(lái)研究的目標(biāo)。

1 Tsujimoto M，Hattori A. The oxytocinase subfamily of M1 aminopeptidases［J］. Biochim Biophys Acta，2005，1751(1):9 -18

2 Forloni M，Albini S，Limongi MZ，et al. NF-kappaB，and not MYCN，regulates MHC class I and endoplasmic reticulum aminopepti -dases in human neuroblastoma cells［J］. Cancer Res，2010，70(3):916 -924

3 Saveanu L，Carroll O，Lindo V，et al. Concerted peptide trimming by human ERAP1 and ERAP2 aminopeptidase complexes in the endoplasmic reticulum［J］. Nat Immunol，2005，6(7):689 -697

4 Kim S，Lee S，Shin J，et al. Human cytomegalovirus microRNA miR-US4 -1 inhibits CD8(+)T cell responses by targeting the amino-peptidase ERAP1［J］. Nat Immunol，2011，12(4):984 -991

5 Andres AM，Dennis MY，Kretzschmar WW，et al. Balancing selection maintains a form of ERAP2 that undergoes nonsense - mediated decay and affects antigen presentation［J］. PLoS Genet，2010，6(10):e1001157

6 Evnouchidou I，Kamal RP，Seregin SS，et al. Cutting Edge:coding single nucleotide polymorphisms of endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 can affect antigenic peptide generation in vitro by influencing basic enzymatic properties of the enzyme［J］. J Immunol，2011，186(4):1909 -1913

7 Kochan G，Krojer T，Harvey D，et al. Crystal structures of the endoplasmic reticulumaminopeptidase - 1 (ERAP1)reveal themolecular basis for N-terminal peptide trimming［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(19):7745 -7750

8 Birtley JR，Saridakis E，Stratikos E，et al. The crystal structure of human endoplasmic reticulum aminopeptidase 2 reveals the atomic basis for distinct roles in antigen processing［J］. Biochemistry，2012，51(1):286 -295

9 Goto Y，TanjiH，Hattori A，et al. Glutamine -181 is crucial in the enzymatic activity and substrate specificity of human endoplasmic-reticulum aminopeptidase-1［J］.Biochem J，2008，416(1):109 -116

10 Blanchard N，Kanaseki T，Escobar H，et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells［J］. J Immunol，2010，184(6):3033 -3042

11 Fierabracci A，Ayroldi E. Experimental strategies in autoimmunity:antagonists of cytokines and their receptors，nanocarriers，inhibitors of immunoproteasome，leukocyte migration and protein kinases［J］. Curr Pharm Des，2011，17(29):3094 -3107

12 Weidemann AK，Crawshaw AA，Byrne E，et al. Vascular endothelial growth factor inhibitors:investigational therapies for the treatment of psoriasis［J］. Clin Cosmet Investig Dermatol，2013，6:233 -244

13 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，et al. Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］. Nat Genet，2010;42(11):1005 -1009

14 Strange A，Capon F，Spencer CC，et al. A genomewide association study identifies new psoriasis susceptibility loci and an interaction between HLA - C and ERAP1［J］. Nat Genet，2010，42(11):985 -990

15 崔婧，張麗君，李珊珊，等.ERAP1 基因多態(tài)性與漢族人群尋常型銀屑病表型的相關(guān)性研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(11):1161 -1164

16 Yang Q，Liu H，Qu L，et al.Investigation of 20 non-HLA (human leucocyte antigen)psoriasis susceptibility loci in Chinese patients with psoriatic arthritis and psoriasis vulgaris［J］.Br J Dermatol. 2013，168(5):1060 -1065

17 Lysell J，Padyukov L，Kockum I，et al. Genetic association with ERAP1 in psoriasis is confined to disease onset after puberty and not dependent on HLA-C* 06［J］. J Invest Dermatol，2013，133(2):411-417

18 Bergboer JG，Oostveen AM，de Jager ME，et al. Paediatric - onset psoriasis is associated with ERAP1 and IL23R loci，LCE3C_LCE3B deletion and HLA-C* 06［J］. Br J Dermatol，2012，167(4):922 -925

19 Hinks A，Martin P，F(xiàn)lynn E，et al. Subtype specific genetic associations for juvenile idiopathic arthritis:ERAP1 with the enthesitis related arthritis subtype and IL23R with juvenile psoriatic arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2011，13(1):R12

20 Julià A，Tortosa R，Hernanz JM，et al.Risk variants for psoriasis vulgaris in a large case -control collection and association with clinical subphenotypes［J］. Hum Mol Genet，2012，21(20):4549 -4557