不同M 受體亞型拮抗劑在改善失血性休克大鼠微循環障礙中的作用比較

陳穎茜 王文達 胡莎莎 劉天行 曹濟民

毒蕈堿受體(muscarinic receptor)(M 受體)按基因分型目前分為M1、M2、M3、M4 和M5 5 種亞型，這些受體亞型不同程度地表達于外周組織與中樞神經系統［1］。M 受體拮抗劑在臨床中的應用包括非選擇性M 受體拮抗劑阿托品與山莨菪堿用于抗休克治療［2］。失血性休克時內穩態不能維持，可應用大劑量阿托品擴血管，其擴血管的機制可能是機體代償性散熱反應，也可能是阿托品阻斷M 受體后的擴血管效應所致［3，4］。大劑量山莨菪堿對改善感染性休克可能為封閉M 受體、上調α7nAChR 活性而開啟相關抗炎通路［5］。也有研究顯示，敲除M3 受體基因的小鼠，乙酰膽堿不能對一些小動脈產生擴血管作用，或許與血管M 受體直接相關［6］。盡管以前在不同研究層次上觀察到了拮抗M 受體的改善微循環效應，但究竟是何種M 受體亞型介導這種作用，目前并不十分清楚。因此，有必要對M 受體亞型拮抗劑的抗休克作用進行進一步鑒定。本研究在大鼠失血性休克模型上，觀察了M1、M2 和M3 受體拮抗劑對失血性休克大鼠腸系膜微循環的不同影響，試圖闡明何種M受體亞型對改善微循環障礙所起的作用最大，為闡明M 受體拮抗劑抗休克的機制提供實驗依據。

材料與方法

1.動物和試劑:普通級3 ～4 月齡雌性Wistar 大鼠30 只，體重160 ～220g(北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號:SCXK -京-2006)。動物飼養及實驗遵守北京協和醫學院生命倫理委員會的有關規定。替侖西平鹽酸鹽水合物(telenzepine dihydrochloride hydrate)、西貝母堿(imperialine)和4 -二苯乙酰氧-N -甲基哌啶甲碘化物(4 -diphenylacetoxy-N - methylpiperidine methiodide，4 - DAMP)購自Sigma 公司，其他常規試劑購自北京化學試劑公司。

2.動物分組:根據Frank 等［7］的方法建立大鼠失血性休克模型。實驗前將大鼠隨機分為5 組，每組5 只。將每組休克前的數據作為自身正常對照。①對照組:動脈放血(1.5ml/100g)，不給予藥物治療，僅放血后5min 內給予生理鹽水-自體血液混合液體(體積比3∶1)回輸治療;②阿托品治療組:于回輸治療后靜脈推注阿托品，根據文獻［8］選擇阿托品劑量1250mg/kg;③M1 受體拮抗劑替侖西平治療組:根據文獻［9］選擇替侖西平劑量0.22mg/kg;④M2 受體拮抗劑西貝母堿治療組:根據文獻［10］選擇西貝母堿為9.6 ×10-3mg/kg;⑤M3受體拮抗劑4 -DAMP 治療組:根據文獻［11］選擇4 -DAMP劑量0.22mg/kg。以上M 受體拮抗劑的劑量選擇均是在參考有關文獻的前提下，再經過預實驗的量-效關系分析，最終選擇大鼠可耐受的較大劑量。

3. 腸系膜微循環的觀察:實驗中在微循環顯微鏡(B230LED，重慶奧特光學儀器有限公司)高倍鏡下觀察腸系膜上動脈以下第3 級分支的微動脈，用圖像分析系統(PCLB-1A，北京微信斯達科技發展有限公司)觀察微動脈血管口徑、血流速度、血液流態和滲出、出血情況等，并拍攝微血管照片。每組大鼠觀察腸系膜三級微動脈25 條(n =25)，進行藥效的統計學分析。選取觀察微血管時保證休克前、休克后及治療后所觀察的區域基本相同。大鼠動脈血壓下降至40mmHg 即判定為休克狀態。每只大鼠休克10min 后進行觀察，觀察時間5min;之后補液及給藥，10min 后再次觀察5min。

4.統計學方法:應用SPSS 17.0 統計軟件，數據以均數±標準差(±s)表示。采用組間比較和自身對照的方式進行統計學分析。實驗組與對照組之間的比較采用t 檢驗和方差分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1. 不同M 受體拮抗劑對失血性休克時微循環血流狀態變化的影響:實驗中微循環血流狀態的變化見表1。所觀察到的血流狀態顯示，阿托品和M1 受體拮抗劑替侖西平的改善微循環作用最明顯，而M2 和M3 受體拮抗劑基本未能顯示改善微循環的作用。

表1 不同M 受體拮抗劑作用后血流狀態變化情況

2.不同M 受體拮抗劑對失血性休克時微循環血管口徑的影響:由于微循環狀態的變化直接與微動脈管徑的變化有關，本研究進一步觀察和統計了不同M受體拮抗劑對休克大鼠微循動脈口徑的變化。與休克前相比，休克后腸系膜微動脈出現典型的收縮狀態(圖1)。單純生理鹽水-自體血液回輸后微動脈管徑進一步減小，休克進一步發展。但由于補液是失血性休克的對癥治療方案，故藥物治療均需以補充足量體液為前提。

圖1 大鼠休克前、休克后及給予M1 受體拮抗劑后腸系膜微循動脈口徑變化的代表性顯微照片

應用阿托品及替侖西平治療后，相比于休克狀態時，大鼠口唇顏色稍變紅潤。應用西北母堿治療后口唇顏色變化不明顯。應用4 -DAMP 后，大鼠生理狀況迅速惡化，皮膚黏膜迅速變紫，心搏變得微弱，大部分動物均在進行微循環測量前死亡，微動脈管徑迅速變小，甚至由于放大倍數不足而難以測量其數據，僅有少數在死亡前測得微動脈管徑數據。各組休克前、休克后及治療后的微動脈平均直徑見表2。由于不同微血管的口徑可能有所不同，盡管表2 給出了微動脈(n=25)平均直徑的變化，但仍可能存在抽樣不足帶來的偏差。為了使各組數據更具可比性，本研究以每組動物休克前的微動脈直徑作為參照(1 或100%)，再將各組動物休克后及治療后微動脈直徑變化的百分率進行了比較(圖2)。結果表明，失血性休克后腸系膜三級微動脈直徑的變化百分率明顯增大，提示微動脈收縮。阿托品及M1 受體拮抗劑替侖西平治療后呈現微動脈明顯舒張，與休克前的微動脈直徑相比，百分率變化減小。M2 受體拮抗劑西貝母堿和M3 受體拮抗劑4 -DAMP 則均不能改善微動脈的收縮(圖2)。

表2 各組休克前、休克后及治療后腸系膜微動脈平均直徑的變化(μm，每組微動脈n=25)

圖2 休克前后及治療后大鼠腸系膜微動脈直徑的百分率變化(每組n=25)

討 論

本研究通過腸系膜微循環觀察直接證明了臨床上補充足量體液后給予大量阿托品治療休克的有效性，并顯示經M1 受體拮抗劑治療后休克大鼠微循環障礙的情況有明顯改善，而M2 及M3 受體拮抗劑則沒有改善休克微循環障礙的作用，休克進一步發展［12］。由于本研究為全身用藥，考慮到M1 受體分布于胃壁細胞、神經節和中樞神經系統，從全身作用來看，替侖西平可能作用于神經節的M1 受體，對交感神經產生了抑制作用，減少了兒茶酚胺的釋放，緩解了微動脈的收縮［13］。另一種可能是，腸系膜微循環表達M1 受體，替侖西平可通過拮抗腸系膜微循環M1 受體，使微循環血管擴張，進而改善休克時的微循環障礙。

現有研究表明，M2 受體主要分布于心臟、腦和自主神經節，激動后引起心臟收縮力和心率降低。若M2 受體在腸系膜微循環上也起著類似激動副交感神經的作用，則M2 受體拮抗劑作用后會導致內臟血管的收縮，與本實驗結果相符。M3 受體分布于外分泌腺、平滑肌、血管內皮、腦和自主神經節，激動后引起平滑肌松弛和腺體分泌［12］。本研究結果提示腸系膜微循環上可能存在M3 受體，M3 受體拮抗劑可阻斷M3 受體對平滑肌的松弛作用，導致微動脈迅速收縮，從而使休克進一步發展。

整體動物實驗雖能較好地模擬臨床治療過程，但也僅能從全身作用了解各M 受體亞型拮抗劑在抗休克治療作用中的權重，全身給予M 受體拮抗劑治療休克可能存在多個靶點。在隨后的研究中可通過局部血管內給藥精確地確定微循環M 受體亞型的分布和功能。

總之，本實驗進一步探討了大劑量非選擇性M受體拮抗劑(以阿托品為代表)治療休克時起主要作用的M 受體亞型，并發現了各M 受體拮抗劑各自的全身綜合效應，可為臨床針對性用藥提供參考。若在臨床上能夠選用對M1 受體選擇性更強的M 受體拮抗劑，則其正向治療作用不會受到M2、M3受體的負向作用干擾，可更有效地治療休克，并減少由于多種作用位點帶來的不良反應。本研究為揭示M受體拮抗劑抗休克的機制提供了一定的整體實驗依據，對于開發選擇性更高的M 受體亞型拮抗劑有一定啟示意義。

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