陽離子脂質體介導的A20 基因轉染人外周血單核細胞的可行性

徐 丹 曲 鵬 高 靜 崔 影

陽離子脂質體轉染技術是當前研究特定基因表達調控及基因治療的重要技術之一，其優越性主要表現在簡單、安全、毒性低、不限制所攜帶DNA 的大小、易大量制備等多個方面，已經被廣泛應用于各種原代細胞及細胞系的轉染［1］。人外周血單核細胞是參與免疫炎癥反應重要的功能細胞，是在醫學基礎研究及臨床檢驗中常用的一類細胞，目前國內外關于人外周血單核細胞的轉染方法及轉染效率的報道相對較少。本研究組采用綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)作為報告基因，通過脂質體Lipofectamine TM 2000 包裹A20 基因，體外轉染人外周血單核細胞，探討脂質體介導A20 基因轉染人外周血單核細胞的可行性及最佳轉染條件，作為我們研究組的預實驗，為外源性A20 基因后續體外及動物干預試驗研究奠定基礎。

材料與方法

1.材料:高效真核表達載體pCAGGS -GFP/A20 由比利時根特大學分子生物學系Dr K. Heyninck 和Prof. R. Beyaert提供;Lipofectamine TM 2000 轉染試劑購自Invitrogen 公司;pCAGGS 質粒、pCAGGS-GFP 質粒、RT -PCR 試劑盒以及引物的設計、合成由寶生物工程(大連)有限公司構建;胎牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;DMEM 培養基購自GIBCO 公司;Ficoll 細胞分離液購自上海普非生物有限公司。

2.技術路線:(1)Ficoll 淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞。(2)pCAGGS -GFP/A20 重組質粒的鑒定:將獲得的pCAGGS-GFP/A20 質粒菌保涂Amp 抗性的平板后，過夜培養。挑單菌落于3ml Amp 抗性的LB 培養基中37℃搖床中過夜培養，集菌后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 進行小量質粒提取，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ進行雙酶切鑒定，酶切產物1%瓊脂糖凝膠電泳。(3)無內毒素質粒的大量提取:將鑒定好的pCAGGS -GFP/A20 質粒菌保接種于100ml Amp 抗性的LB 培養基中過夜培養后，使用QIAGEN公司的Endo -Free Plasmid Maxi kit 進行無內毒素質粒的提取，溶于試劑盒中的TE 緩沖液，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ進行雙酶切鑒定，酶切產物1%瓊脂糖凝膠電泳。將質粒DNA 提取物按適當比例稀釋，置核酸濃度測定儀內，測定DNA 濃度，并用真空濃縮機將質粒濃度調整至1μg/μl。(4)pCAGGS -GFP/A20 質粒轉染條件的篩選:根據表1 及表2 對Lipofectamine TM 2000 轉染試劑和pCAGGS-GFP/A20 質粒稀釋，分別取20μl 于稀釋的轉染試劑與25μl 稀釋質粒的混合，在室溫保溫15min，然后將混合后的復合物加到24 孔板的細胞中，輕輕混勻。在孵箱中孵育5h，5h 后，棄去含有復合物的培養基，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基。轉染48h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達情況，計算表達GFP 單核細胞數與所有細胞數的比值，多張片子多個角度取平均值，選取單核細胞GFP 表達強度最強，表達數量最多的一組確定最佳轉染條件，詳見圖1。(5)目的基因的檢測:將實驗設A1 組(空白對照組);A2 組(轉染試劑組，培養液中加入Lipofectamine TM 2000 4μl，作用48h);A3 組(pCAGGS 組，轉染空質粒3μg 作用48h);A4 組(pCAGGS-GFP 組，轉染不含目的基因的質粒3μg 作用48h);A5 組(pCAGGS-GFP/A20 組，轉染含有目的基因A20 的質粒3μg 作用48h)，加入脂質體轉染試劑及質粒含量按篩選出的最佳轉染條件進行，通過熒光顯微鏡檢測各組GFP 報告基因，RT-PCR 檢測目的基因A20 的表達。(6)反轉錄聚合酶鏈式反應(RT -PCR):PCR 引物及擴增片段:外源性A20 引物:上游引物:5' - TTT GAG CAA TAT GCG GAA AGC -3';下游引物:5' -AGT TGT CCC ATT CGT CAT TCC-3'，擴增片段長度319bp;β-actin 引物，上游引物:5' -AAC GAG CGG TTC CGA TGC CCT GAG -3'，下游引物:5' -TGT CGC CTT CAC CGT TCC AGT T-3'，擴增片段長度為249bp;外源性A20 反應條件:94℃5min，94℃50s，60℃58s，72℃60s，共進行30 個循環，最后72℃8min。

圖1 pCAGGS-GFP/A20 質粒與轉染試劑篩選比例

表1 Lipofectamine TM 2000 轉染試劑的稀釋方法(μl)

表2 質粒的稀釋方法

結 果

1.pCAGGS-GFP/A20 質粒轉染條件的優化:在倒置熒光顯微鏡下，以488nm 激發光波長激發熒光，察綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的表達，同一視野同時在熒光顯微鏡下及普通光鏡下觀察及攝片，計算表達GFP 細胞數與所有細胞數的比值，多張片子的多個視野取平均值，可見5C 孔表達最強，詳見圖2，即對于24 孔板的亞融合細胞來說，最佳脂質體與質粒的量之比為4μl∶3μg，確定了優化條件后就可以根據培養板表面積線性放大，進行本研究的干預實驗。

圖2 pCAGGS-GFP/A20 質粒轉染條件篩選結果

2.單核細胞轉染后GFP 表達:熒光顯微鏡可見(圖3):A1 組(空白對照組)，A2 組(轉染試劑組)及A3 組(pCAGGS 組)單核細胞胞質內均未見GFP 表達，而A4 組(pCAGGS -GFP 組)，A5 組(pCAGGS -GFP/A20 組)，兩組單核細胞胞質內可見GFP 表達，提示真核表達載體pCAGGS 在單核細胞內轉染成功。

圖3 GFP 表達的特異性檢測結果(×400)

3. RT -PCR 檢測目的基因A20mRNA 表達:外源性A20mRNA 與β -actin RT -PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳可見(圖4)，A1 組(空白對照組)、A2 組(轉染試劑組)、A3 組(pCAGGS 組)、A4 組(pCAGGS-GFP 組)各組均未檢測到外源性A20mRNA 的表達，而A5(pCAGGS -GFP/A20 組)組可檢測到目的基因A20mRNA 的表達，提示Lipofectamine TM 2000介導的pCAGGS -GFP/A20 質粒轉染可獲得目的基因A20 的表達。

討 論

圖4 外源性A20mRNA 與β-actinRT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

新鮮分離的健康人外周血單核細胞是處于G0期、非分裂的原代細胞，這種細胞特性至少維持到體外分離后3 天以上，因此很難將外源基因導入單核細胞內，并獲得高效表達［2，3］。作為真核細胞轉染方法，脂質體轉染技術的優越性主要表現在毒性低、對于所攜帶DNA 的大小無特殊要求、易大量制備等方面［4］。

更為重要的是，脂質載體的免疫原性通常較低，允許在體內轉染實驗時使用與體外實驗相同的載體。陽離子脂質體通過靜電作用與攜帶外源性目的基因的治療結合形成脂質體復合物，然后被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞作用進入溶酶體，內吞后脂復合體在細胞內形成的包涵體，在二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)作用下，細胞膜上的陰離子脂質因膜的不穩定而失去原有的平衡擴散進入復合體，與陽離子脂質中的陽離子形成中性離子對，使原來與脂質體結合的DNA 游離出來，進入細胞質，進而通過核孔進入細胞核，最終進行轉錄并表達［5～7］。其轉染效率與脂質體與DNA 的比例、細胞狀態、轉染時間以及靶細胞的選擇性作用有關。一般認為，環狀DNA 的轉染效率高于線狀DNA，越小的基因其轉染效率越高［8～10］。

我們研究中應用的目的基因A20 為比利時根特大學分子生物學教研室構建的環狀DNA，根據本研究組后續的動物實驗需要，我們應用了陽離子脂質體轉染方法對人外周血單核細胞進行外源性基因A20的轉染實驗，在本試驗條件下，Lipofectamine TM 2000 轉染試劑與pCAGGS - GFP/A20 質粒比例為4μl∶3μg 轉染效果最佳，研究中我們發現，轉染試劑本身的毒性會對體外培養的人外周血單核細胞的生長狀態產生一定的影響，在轉染過程中需要更換新的培養基以降低轉染試劑對單核細胞的毒性，換液時間過早，脂質體/DNA 復合物因不能有效被內吞至胞體內而導致轉染率相對較低，而換液時間過晚則會因為轉染試劑的不良反應影響細胞狀態，甚至會導致單核細胞活性降低，甚至是大量死亡，轉染效率也會降低在本試驗條件下，當轉染后5h 更換培養液可獲得相對較高的轉染效率。本實驗作為研究組的預實驗，通過陽離子脂質體轉染方法使得外源性A20基因在單核細胞獲得了瞬時表達，未進行抗菌素的篩選。

本研究應用陽離子脂質體Lipofectamine TM 2000 介導外源性A20 基因轉染人外周血單核細胞，通過GFP 報告基因以及RT-PCR 檢測證實pCAGGS-GFP/A20 組轉染后經培養至48h，獲得了A20 基因的表達，從而證實了表達載體pCAGGS-GFP/A20 的有效性，為外源性A20 基因干預單核細胞炎癥反應的研究以及動物干預實驗打下良好基礎。

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