陽離子脂質體介導的A20 基因轉染人外周血單核細胞的可行性

徐 丹 曲 鵬 高 靜 崔 影

陽離子脂質體轉染技術是當前研究特定基因表達調控及基因治療的重要技術之一，其優越性主要表現在簡單、安全、毒性低、不限制所攜帶DNA 的大小、易大量制備等多個方面，已經被廣泛應用于各種原代細胞及細胞系的轉染［1］。人外周血單核細胞是參與免疫炎癥反應重要的功能細胞，是在醫學基礎研究及臨床檢驗中常用的一類細胞，目前國內外關于人外周血單核細胞的轉染方法及轉染效率的報道相對較少。本研究組采用綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)作為報告基因，通過脂質體Lipofectamine TM 2000 包裹A20 基因，體外轉染人外周血單核細胞，探討脂質體介導A20 基因轉染人外周血單核細胞的可行性及最佳轉染條件，作為我們研究組的預實驗，為外源性A20 基因后續體外及動物干預試驗研究奠定基礎。

材料與方法

1.材料:高效真核表達載體pCAGGS -GFP/A20 由比利時根特大學分子生物學系Dr K. Heyninck 和Prof. R. Beyaert提供;Lipofectamine TM 2000 轉染試劑購自Invitrogen 公司;pCAGGS 質粒、pCAGGS-GFP 質粒、RT -PCR 試劑盒以及引物的設計、合成由寶生物工程(大連)有限公司構建;胎牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;DMEM 培養基購自GIBCO 公司;Ficoll 細胞分離液購自上海普非生物有限公司。

2.技術路線:(1)Ficoll 淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞。(2)pCAGGS -GFP/A20 重組質粒的鑒定:將獲得的pCAGGS-GFP/A20 質粒菌保涂Amp 抗性的平板后，過夜培養。挑單菌落于3ml Amp 抗性的LB 培養基中37℃搖床中過夜培養，集菌后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 進行小量質粒提取，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ進行雙酶切鑒定，酶切產物1%瓊脂糖凝膠電泳。(3)無內……