經(jīng)典恒溫加速試驗法預測健腦益智膠囊的有效期

柳小莉 趙曉平 范小璇 侯 文 郭東艷

健腦益智膠囊為陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，處方由水蛭、葛根、白茅根、郁金等藥味組成。具有化瘀利水，豁痰開竅的功效，臨床上主要用于顱腦損傷后腦組織水腫和微循環(huán)障礙引起的各種癥狀。其中水蛭為方中君藥，有效成分為水蛭素，水蛭素遇熱不穩(wěn)定，《中國藥典》2010 年版一部水蛭項下采用抗凝血酶活性進行定量。因處方中干擾因素較多，不能準確測定其抗凝效價的變化，因而選用臣藥葛根中的有效成分葛根素為指標成分［1，2］，采用經(jīng)典恒溫加速試驗法及高效液相色譜法對其進行含量測定，預測健腦益智膠囊的有效期。

材料與方法

1.儀器:Agilent 高效液相層析儀(美國安捷倫公司);Al204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);BT25s 十萬分之一電子天平(上海天美儀器有限公司);501 型超級恒溫水浴鍋(上海實驗儀器有限公司);KH-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

2.藥材與試劑:健腦益智膠囊(陜西中醫(yī)學院中藥制劑室自制，批號為20120819);葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，供含量測定用，批號為110752 -200511);甲醇為層析純;水為重蒸餾水。

3.方法:(1)取樣:取健腦益智膠囊150 粒，分成25 份，將各份樣品置具塞試管中密封，分別放于60、70、80、90、100℃超級恒溫水浴鍋中，按各設定時間取出，立即放入水中冷卻，備用。(2)葛根素含量測定方法學考察:層析條件:層析柱為Thermo BDS C18(5μm，4.6 ×250nm)，以甲醇-水(25∶75)為流動相;檢測波長250nm;流速為1. 0ml/min;柱溫為25℃。(3)對照品溶液的制備:取對照品0.87mg，精密稱定，加30%乙醇制成每1ml 含87μg 的溶液，即得。(4)供試品溶液的制備:取上述的具塞試管中健腦益智膠囊內(nèi)容物約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過，即得。(5)標準曲線的繪制:精密吸取對照品溶液(87μg/ml)3ml，定容至10ml 容量瓶中。分別精密吸取2、4、6、8、10、12μl注入液相層析儀，按照優(yōu)選的層析條件進行測定，以對照品溶液進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。

結 果

1.葛根素方法學考察結果:按照優(yōu)選的色譜條件，以對照品溶液進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，標準曲線見表1，不同溫度和不同時間條件下，葛根素含量測定結果見表2。以對照品溶液進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，可得回歸方程為:y=110.87x-7.12，R=1，說明葛根素濃度在0.0522 ～0.3132μg 范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈較好的線性關系。

表1 葛根素對照品標準曲線

2.K 值的計算:以不同時間不同條件下葛根素含量的對數(shù)lgc 對時間t 作圖，得到各溫度下的回歸方程，符合一級反應方程式lgC = -kt/2.303 +lgC0，可確定葛根素含量隨時間變化符合化學動力學一級反應。再由回歸方程斜率求出各溫度下藥物降解反應速度常數(shù)K 值［3］，結果見表2。

表2 不同溫度和不同時間條件下葛根素含量的測定結果［3］

3.反應活化能的計算:根據(jù)各溫度下的KS 值得出lgK，結果見表3。以lgK 對1/T 作圖，進行線性回歸，得回歸方程:lgK = -4669.6 ×1/T +10.639，r =0.9929。由Arrhenius 指數(shù)定律:lgK = -E/2.303RT+lgA 及直線斜率求出活化能E =89.463kJ/mol，在(41.84 ～125.52)kJ/mol 范圍內(nèi)，說明用經(jīng)典恒溫法預測室溫下葛根素的穩(wěn)定性有實際意義。

表3 溫度與速度常數(shù)表

4. 室溫下有效期t0.9的計算:將回歸方程lgK =-4669.6 ×1/T+10.639(r=0.9929)，外推可得室溫25℃(T =273 +25)時的K25℃=9.32 ×10-6/h，從而可計算出在室溫25℃下有效成分減少10%所需的時間，即有效期t0.9，t0.9=0.1054/K25℃=11309h =1.29a(年)。

討 論

采用經(jīng)典恒溫加速試驗法預測健腦益智膠囊的有效期，設置了試驗的溫度和時間，試驗過程中可觀察到，隨著溫度升高，時間延長樣品顏色加深，其中100℃下樣品的顏色最深。經(jīng)高效液相層析法測得的含量隨著溫度升高，時間延長，葛根素含量逐漸降低。經(jīng)試驗，在密閉條件下，預測健腦益智膠囊有效期為1.29 年，有效期時間偏短。關于健腦益智膠囊的有效期還有待于結合長期留樣觀察法結果進一步進行確定。

1 潘平康，張超，吳海琴，等. 葛根素對大鼠腦缺血后海馬中EPO 和STAT-5 表達的影響［J］. 卒中與神經(jīng)疾病，2013，20(3):137 -140

2 梅志剛，王明智，劉曉潔，等. 葛根素對大鼠腦缺血再灌注損傷α7nAChR、NF-κB p65 及STAT3 mRNA 表達的影響［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(1):113 -117

3 洪清，袁曦，王友芳，等. 多元線性模型和經(jīng)典恒溫法預測天寧滴丸有效期［J］. 中國現(xiàn)代應用藥學，2013，30 (4):416 -419