低氧下動脈粥樣硬化大鼠KLF2 和eNOS 基因表達差異的研究

盧東東 周白麗

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見的動脈血管硬化性疾病，其病變主要累及體循環系統的大中型肌彈力型動脈。隨著社會經濟發展及人們生活方式的改變，動脈粥樣硬化的發生率呈現逐年上升的趨勢。而近年來的研究發現KLF2 參與血管內皮功能的調節對維持血管內環境的平衡有著重要的作用，且KLF2 可通過上調血管保護性因子及下調血管炎性因子的表達參與血管內皮細胞功能的調節［1～3］。眾所周知，eNOS 在血管生成和血管內皮細胞遷移扮演著重要的角色，它可催化血管內皮生成一氧化氮(NO)，對維持血管內皮細胞的功能有著重要的作用［4］。近年來對低氧下細胞功能和細胞信號的研究成為低氧生理研究的熱點，青藏高原平均海拔在4000 米以上，高原缺氧條件下動脈粥樣硬化的病理生理與平原地區有一定的差異。目前有關急性缺氧下動脈粥樣硬化的研究較少，本課題使用低壓氧艙模擬急性缺氧環境，通過研究不同急性缺氧時間下兩組大鼠主動脈中KLF2 和eNOS 的表達的差異，探討KLF2 在低氧條件下對細胞內皮功能的影響。

材料與方法

1.實驗動物、試劑及主要儀器:(1)實驗動物:雄性健康Wistar 大鼠47 只，由蘭州大學實驗動物中心提供(實驗動物合格證號:0002511)。(2)主要試劑:牛血白蛋白、尼古丁(北京久峰潤達生物技術有限公司)、維生素D3(大連美侖生物技術有限公司)、卵清白蛋白(美國Sigma 公司)、RNA 快速提取試劑盒(北京久峰潤達生物技術有限公司)、cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)、Taq DNA 聚合酶(北京天恩澤基因科技有限公司)、KLF -2、eNOS、GAPDH 引物(德國QIAGEN 公司QuaintTect?Primer Assay，貨號分別為:QT01294272、QT00414085、QT00199633。注:具體引物序列因涉及知識產權保護，QIAGEN 公司未提供具體引物序列);(3)實驗儀器:低溫超速離心機(德國Eppendorf-5424R)、全自動生化分析儀(德國羅氏Modular DPP)、PCR 儀(德國Eppendorf Master- cycler PCR 儀)、凝膠成像系統(美國Bio - Rad 公司)、OLYMPUS 光學顯微鏡等。

2.動脈粥樣硬化造模及分組:實驗大鼠隨機分為兩組(造模組23 只、對照組24 只。因西寧地處青藏高原東北部，平均海拔2260 米，故未放入低壓氧艙大鼠均為慢性缺氧大鼠)。造模組給予:牛血白蛋白32mg/kg 尾靜脈注射，3 次/周，共9次;卵清白蛋白2.5mg/kg 腹腔注射，1 次/3 日，共5 次;維生素D325 萬U/kg 灌胃，連續3 天。參考王園園等［5］關于大鼠動脈粥樣硬化模型建立和評價的方法;尼古丁1mg/kg 腹腔注射，共2 周。參考Lou 等［6］血管內皮損傷模型造模方法;同時給予高脂飼料(上海斯萊克實驗動物公司提供:豬油16.2%、蔗糖10.8%、酪蛋白9.6%、膽固醇1.3%、膽鹽0.3%、甲基硫氧嘧啶0.1%)喂養，不限飲水。對照組給予同等量生理鹽水處理、給予普通飼料喂養，不限飲水。

3.血脂檢測:分別于造模開始前、造模6 周、造模12 周經大鼠尾靜脈取血約0.5ml，離心后取上清，于-80℃保存，采血結束后同時送至青海省人民醫院檢驗科使用全自動生化儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。

4.急性缺氧模型:于造模結束后分別在造模組和對照組中隨機選取15 只大鼠，同時放入青海大學醫學院高原醫學中心低壓氧艙，設定時間分別為4、8、12h，分別為急性缺氧4、8、12h 造模組和急性缺氧4、8、12h 對照組，未放入低壓氧艙大鼠為急性缺氧0h 組(既慢性缺氧組，分別為慢性缺氧造模組和慢性缺氧對照組)，設定艙內海拔為5000 米，模擬高海拔低壓低氧環境，到達設定時間后取出大鼠及時處死，留取標本。

5.主動脈形態觀察:處死動物后取主動脈，剝離外膜脂肪組織，取胸主動脈約1cm，切成0.3cm 小段，放入10%中性甲醛溶液中固定過夜，常規脫水、石蠟包埋，連續切片，每個標本取3 張切片，經HE 染色后在光學顯微鏡下觀察主動脈形態。

6.半定量RT -PCR 檢測KLF2、eNOS、GAPDH 基因的表達:處死動物后，取主動脈，于-80℃保存。使用RNA 快速提取試劑盒提取大鼠主動脈組織中總RNA，溶于DEPC 水中，測定OD260/280 比值為1.85 ～1.96。取1.0μg 總RNA，用cDNA 第1 鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA 后，取1μl 反轉錄產物行PCR 反應，反應條件:94℃預變性4min、94℃變性30s、60℃退火45s、72℃延伸1min、72℃最終延伸10min，共35 次循環。PCR 結束后取10μl 反應產物在1.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束后在凝膠成像系統下拍照，用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

7.統計學方法:使用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.大鼠不同時期血脂水平比較:造模6 周時造模組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量明顯高于同時期對照組(P ＜0.05);造模6 周時造模組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量明顯高于造模前造模組大鼠(P ＜0.05);造模12 周時造模組大鼠血清TC、TG、LDL 含量明顯高于同時期對照組(P ＜0.05);造模12 周時造模組大鼠血清TC、TG、LDL 含量明顯高于造模前及造模6 周大鼠(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 兩組大鼠不同時期血脂水平的比較(mmol/L)

2.大鼠主動脈形態觀察(圖1):光鏡下，對照組大鼠主動脈內膜光滑完整，內皮細胞無增生，中膜平滑肌細胞、彈力纖維排列整齊連續、無中斷;慢性持續缺氧造模組大鼠動脈內膜呈現不均一增厚，內膜細胞排列紊亂，中膜平滑肌細胞排列紊亂，中層彈力纖維鈣化明顯，排列紊亂，有不同程度的斷裂和破壞，部分嚴重鈣化，凸向血管腔，有少量泡沫細胞聚集;急性缺氧12h 造模組大鼠主動脈內皮細胞增生，內膜增厚明顯，細胞排列紊亂，血管腔面不光整，血管中膜纖維組織增生，并有大量細胞碎片及鈣化組織沉積，凸向血管腔。

3.半定量RT-PCR 檢測大鼠KLF2、eNOS、GAPDH 基因的表達:(1)造模組大鼠給予急性缺氧4、8h處理后，造模組大鼠KLF2 表達水平明顯高于相同急性缺氧時間對照組(P ＜0.05);造模組大鼠急性缺氧12h 組KLF2 表達水平明顯低于慢性缺氧造模組和急性缺氧4h 造模組(P ＜0.05);慢性缺氧造模組大鼠KLF2 表達水平高于慢性缺氧對照組大鼠(P ＜0.05);急性缺氧12h 造模組組與急性缺氧12h 對照組比較無統計學差異(P ＞0.05)。(2)造模組大鼠給予急性缺氧4、8h 處理后，造模組大鼠eNOS 表達水平明顯高于相同缺氧時間對照組(P ＜0.05);急性缺氧缺氧12h 對照組eNOS 表達水平明顯高于慢性缺氧對照組和急性缺氧4h 對照組(P ＜0.05);慢性缺氧造模組大鼠eNOS 表達水平明顯高于慢性缺氧對照組(P ＜0.05)，詳見表2，圖2、圖3。

圖1 不同缺氧時間動脈粥樣硬化大鼠主動脈病理改變(HE 染色，10 ×40)

表2 兩組大鼠不同急性缺氧時間KLF2、eNOS、GAPDH 的表達

圖2 兩組大鼠不同缺氧時間KLF2、eNOS、GAPDH 表達的比較

討 論

圖3 兩組大鼠不同缺氧時間KLF2、eNOS 的表達水平比較

KLFs 是鋅指樣轉錄因子家族的總稱，是已經被證明了在多種細胞類型和器官系統中能廣泛調節多種生理學和病理學過程的轉錄因子之一［7］。值得注意的是，在過去10 年的研究中認為KLFs 在多種細胞如內皮細胞(ECs)、巨噬細胞以及平滑肌細胞(SMCs)中可作為AS 的保護因子［8］。KLF2 是KLFs家族成員之一，它在內皮細胞以及與內皮細胞相關的細胞中高表達并充當“分子開關”的作用，因其在內皮細胞中起著抗炎、抗血栓形成、舒張血管、抗血小板的功能而發揮維持血管內皮功能平衡的作用［9］。eNOS 是一氧化氮合酶(NOS)3 種亞型之一，它可催化血管內皮生成一氧化氮(NO)協調血管內皮功能［4］。有文獻報道隨著急性缺氧時間的延長，eNOS在對照組大鼠中的表達逐漸增高，提示eNOS 在血管內的活化機制可能還有低氧的刺激有關［10］。

AS 的發病機制包括血管內皮和平滑肌細胞功能異常、白細胞浸潤及其促炎作用的激活等方面，有研究發現在AS 小鼠中KLF2 表達是減少的［11］。其中的兩個基因eNOS 和血栓調節蛋白已經被證實與KLF2 監管和啟動子區域相關［1～3］。低層流條件可誘導KLF2 的表達，從而導致下調炎性基因如血管細胞黏附因子(VCAM)和E-選擇素的表達，并上調血管保護性基因如內皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)表達［1～3，12，13］。KLF2 通 過 募 集cAMP 途 徑 效 應 因 子CBP/300 轉錄共激活因子調節血管內皮細胞的增殖與活化［2］。本研究中KLF2 高表達的大鼠eNOS 的表達也是升高的，與Lin 等的研究的結果相一致。同時KLF2 可通過感應動脈粥樣硬化血管血流動力學剪切應力的變化調節血管內皮細胞炎癥效應的活化效應，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成［14］。

高原缺氧對人體多個系統包括心血管系統、呼吸系統等功能發生改變。在缺氧環境下，動脈粥樣硬化斑塊的穩定性較常氧條件有所下降。張司蘭等［15］的研究指出在低壓低氧條件下，多個導致斑塊穩定性下降的基因表達量升高，導致低壓低氧條件下動脈粥樣硬化斑塊的穩定性下降。同時呂云輝等［16］的研究提示在低壓低氧狀態下，AS 斑塊的穩定性下降，而心血管系統受到低氧、高二氧化碳等刺激時，自主神經的活性增加，通過調節血管內皮分泌多種血管活性物質來調節血管張力，導致血管內皮功能和血管張力發生變化，從而可引起動脈硬度和血壓的變化。由此可知在低氧條件對AS 斑塊的穩定性等各方面有一定的影響，本實驗中觀察到急性缺氧12h 造模組動脈粥樣硬化病變較慢性缺氧造模組嚴重，提示急性缺氧條件可加重AS 病變的嚴重程度。

KLF2 和eNOS 對維持血管內皮細胞功能的穩定有著重要的作用，是血管內皮細胞的保護因子。Hae-Young 等［17］研究發現FOXO1 是一個負向調節KLF2 表達轉錄因子，并指出Fox 轉錄因子- 1(FOXO1)通過抑制對血管內皮細胞保護因子的表達從而引起血管內皮功能的損害。提示KLF2、eNOS 可能通過FOXO1 介導的轉錄調控參與了血管內皮細胞功能的調節。有研究提示，與常氧條件相比，在低氧條件下骨髓間質細胞內FOXO1 的表達是升高的［18］。但是在急性缺氧條件下動脈粥樣硬化大鼠主動脈組織中KLF2 表達量的改變是否與FOXO1 途徑相關還需進一步實驗驗證。

筆者的研究結果表明，急性缺氧條件能刺激對照組大鼠eNOS 的表達，從而發揮血管內皮功能調節的作用，且隨著急性缺氧時間的延長，對照組大鼠主動脈中eNOS 的表達逐漸增高。同時我們的研究發現慢性持續缺氧造模組KLF2 表達水平明顯高于慢性持續缺氧對照組，而在急性缺氧條件下，造模組KLF2表達水平逐漸下降尤其在急性缺氧12h 組，KLF2 表達水平明顯低于慢性持續缺氧條件，說明急性的缺氧刺激能抑制動脈粥樣硬化大鼠中KLF2 基因的激活從而導致KLF2 表達水平的降低，提示KLF2 在急性缺氧條件下也參與了動脈粥樣硬化血管組織中內皮細胞功能的調節，慢性持續缺氧條件能刺激動脈粥樣硬化大鼠中KLF2 的表達，但其具體的機制還需要進一步深入研究探討。這些可能為在低氧下研究動脈粥樣硬化的特殊病理生理提供新的研究思路和提示。

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