17β-雌二醇作為擴充液對大隱靜脈保護作用的研究

殷 巍 王 亮 張麗晶 員建平

冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass graft，CABG)是目前國際公認的最有效的治療冠心病方法之一，在冠狀動脈旁路移植術中，自體大隱靜脈因其解剖位置表淺，易于游離，取材方便且有足夠的長度，能夠方便地使病變冠狀動脈遠端的血管與主動脈或其分支連接等優點仍然是目前最常用的橋血管替代材料之一。然而，橋血管內皮細胞的損傷從一開始離取、擴張和保存血管時就已經開始，靜脈橋的損傷導致術后再狹窄和閉塞嚴重影響了其遠期的通暢率，最常見的損傷因素是切取大隱靜脈時通常因為各種原因引起痙攣，操作導致的機械與壓力刺激，引起血管平滑肌局部釋放化學痙攣因子［1，2］。如何提高術后近、遠期通暢率和生存率是當今冠脈外科領域的研究難題之一。本課題從CABG 橋血管擴充液的方面進行研究，目前在國內外還未見有對17β -雌二醇(E2)作為擴充液的報道，而17β-雌二醇在擴血管和防止搭橋術后橋血管再狹窄方面及促心肌血管生成作用的研究已經得到了證實［3～8］。本課題為其能否作為新型擴充液，減輕橋血管VEC 的損傷提供理論依據。

材料與方法

1.臨床資料:(1)研究對象:篩選21 例就診于包頭市中心醫院(2010 年10 月～2011 年11 月)行冠狀動脈旁路移植術(CABG)的患者，取其冠狀動脈旁路移植術后剩余的大隱靜脈。(2)入選標準:所有患者行CABG 術前均通過下肢血管超聲檢查顯示均無大隱靜脈橋曲張損害和其他損害。

2.方法:本研究分兩個階段進行。第1 階段:篩選21 例行CABG 的患者(考慮到人為取血管手術技術不同的對血管損傷因素，本實驗21 例血管均為同一人員所取)取術前未進行擴充的大隱靜脈，留下進行冠狀動脈旁路移植剩余的血管分割成3 段，每段長約2cm 分為3 組，A 組17β - 雌二醇組(n=21);B 組嬰粟堿組(n=21)和C 組自體血液肝素混合組(n=21)，各組用不同的擴充液擴充進行比較。試驗各組取相同擴張壓力1000mmHg 擴張橋血管，擴充時通過靜脈延長管中擴張液形成的小液柱推動前端密閉腔中形成的氣體傳導壓力(整個過程中裝置處于同一水平面，并且保證嚴格無菌操作)壓力表及注射器采用冠狀動脈球囊擴張所用上海產壓力注射器一體，擴充后的血管按要求分別保存在10%甲醛及3%進口戊二醛中，并存放在4℃冰箱保存。擴壓表每次用完一組擴充液后用生理鹽水沖洗3 遍，用完后用醫院高溫壓力鍋消毒，整個過程嚴格保持無菌超作。第2 階段:①擴張后將大隱靜脈各切取1cm 經石蠟包埋切片后經HE 染色和掃描電鏡樣品制備后，并用光鏡和掃描電鏡觀察單位面積血管內皮細胞(VEC)的死亡數目及細胞器的損傷情況［9］;②取1cm免疫組化標記后用光鏡觀察血管內皮細胞(VEC)細胞間黏附分子-1(ICAM-1)來比較各組擴張液血管的損傷情況;③比較3 組擴張液擴張后大隱靜脈內膜VEC 的死亡，以及中膜血管平滑肌的撕裂，通過各組的比較得出對大隱靜脈離取后應用擴張液對血管內膜損傷最小組，在具體的臨床應用上能提高大隱靜脈橋的遠期通暢。

3.觀察血管損害的分級標準:(1)光鏡:按內皮細胞脫落的程度分為4 級:每高倍鏡視野下大隱靜脈固有膜表面內皮細胞所占比例＞75%為1 級，50% ～75%為2 級，25% ～50%為3 級，＜25%為4 級［10］。(2)透射電子顯微鏡:取3 組切片標本，在電子顯微鏡視野下找出能觀察到的內皮細胞和平滑肌細胞數進行統計學分析，應用日本HITACHZ H-700H 電子顯微鏡參照細胞損傷程度分級標準對其超微結構損傷程度進行分級［9］(表1)。(3)免疫組化法:檢測血管內皮細胞(VEC)細胞間黏附分子-1(ICAM -1)的比較來觀察各組應用擴張液血管前后的情況。13 點評分法是以0 ～4 分來判定陽性細胞的百分比:0 分，沒有陽性細胞;1 分，陽性細胞百分比＜10%;2 分，陽性細胞百分比＞10%但＜50%;3 分，陽性細胞百分比＞50%但＜80%;4 分，陽性細胞百分比＞80%。染色強度按陰性、弱、中、強染色分別評為0 ～3 分(染成棕黃色為陽性細胞)。最終的評分是指標的乘積［11］。

表1 細胞損傷程度分級標準

結 果

應用17β -雌二醇和罌粟堿組作為擴充液擴充后的血管通過光鏡觀察藥物擴張后的大隱靜脈內皮細胞脫落較少，1 ～2 級占95%，管壁固有膜，肌層細胞排列整齊，細胞變性較少(表2，圖1)。而自體血肝素混合組作為擴充液擴充后的大隱靜脈內皮細胞大量脫落，Ⅱ～Ⅲ級占90%，固有膜細胞水腫明顯，肌層細胞出現黏液變性及肌纖維變性(表2，圖1)。血管免疫組化及電鏡結果觀察損傷最小，經統計學處理，各組損傷分級差異有統計學意義(P ＜0.05)。應用17β-雌二醇和罌粟堿組作為擴充液擴充后的血管通過透射電鏡觀察藥物擴張后的大隱靜脈內皮細胞和平滑肌細胞超微結構各細胞器較為清晰、完整，按照細胞超微分級標準Ⅱ～Ⅲ級占70%以上，而自體血肝素混合組作為擴充液擴充后的大隱靜脈內皮細胞損害、自溶現象較多，超微結構各細胞器模糊不清有的甚至消失，分級標準Ⅲ～Ⅳ級占70%以上(表3、表4，圖2、圖3)。

表2 光鏡結果

圖1 HE 染色實驗照片(×200)

表3 內皮細胞電鏡結果數量統計(n)

表4 平滑肌細胞電鏡結果數量統計(n)

圖2 免疫組化實驗照片(×100)

圖3 內皮細胞透射電子顯微鏡照片(×15000)

應用17β-雌二醇組作為擴充液擴充后的血管通過免疫組化(ICAM-1)檢測觀察陽性表達最少，按國際上通用13 點評分標準基本在1 分，而自體血肝素混合組作為擴充液擴充后的血管通過免疫組化(ICAM-1)檢測觀察陽性表達最多，按國際上通用13 點評分標準基本在6 分(表5，圖4)。

表5 免疫組化(ICAM-1)

討 論

圖4 平滑肌細胞透射電子顯微鏡照片(×15000)

CABG 手術目前仍是治療冠心病最主要的方法之一。然而，術后橋血管的再狹窄仍是當今困擾全世界心臟外科的一大難題。如何提高術后遠期通暢率和生存率是當今冠脈外科領域的研究難題之一。橋血管離取過程中的過分牽拉，過高的擴張壓力將直接導致血管內皮細胞的脫落，甚至中膜血管平滑肌的撕裂。為了防止高壓擴張血管后所帶來的損害，目前國內外在取完橋血管后常打入的擴充液主要為嬰粟堿液，進行實驗研究的有硝酸甘油- 維拉帕米液等［10～13］。Liu 等［14］研究指出，擴張時生理所能承受的壓力范圍可能為100 ～600mmHg。本課題從CABG橋血管擴充液的方面進行研究，為尋求新型擴充液，減輕橋血管VEC 的損傷，提高CABG 術后橋血管遠期的通暢率提供理論依據。實驗前也通過預實驗得出相同結論，擴張壓力＜1000mmHg 時，血管的損傷較小，不容易比較血管的損傷的情況，因此本實驗擴充血管的擴張壓力選擇1000mmHg。

通過本研究光鏡結果表明，應用17β -雌二醇為擴充液的大隱靜脈內皮細胞損傷最小，罌粟堿組次之，自體血肝素混合組損傷最大，其原因為17β -雌二醇和罌粟堿組在擴充血管時通過其舒血管的機制，有效的防止了大隱靜脈的痙攣，使血管壁平滑肌舒張使整個血管均勻性擴張，靜脈管壁具有彈性，質地較韌，內皮細胞脫落較少，肌層細胞排列整齊，細胞變性較少。17β-雌二醇組優于罌粟堿組其原因可能為17β-雌二醇存在擴血管的機制多于罌粟堿:17β -雌二醇從基因組和非基因組均存在舒血管機制，具體如下:①雌激素從基因組開始阻礙腺苷酸環化酶(cAMP)或鳥苷酸環化酶(cGMP)的激活，減少其的縮血管的機制進而達到其舒血管的目的;②非基因組舒血管機制通過內皮依賴和非內皮依賴發揮其作用。當17β-雌二醇濃度為10-9～10-6mol/L 時，其通過內皮型促進一氧化氮合酶(eNOS)等作用激活鳥甘酸環化酶(GC)，增加細胞內環磷酸鳥苷(cGMP)等機制，進而激活蛋白激酶G(PKG)及K+通道的開放，最終達到舒張血管平滑肌的作用;當17β -雌二醇濃度＞10-5mol/L 時，其舒血管作用通過非內皮依賴，其機制是阻斷血管平滑肌細胞膜上兩種鈣通道進而阻斷所有類型的鉀離子通道達到舒血管目的。而傳統罌粟堿舒血管機制少于雌激素，且罌粟堿液對血管存在多種不利因素:①罌粟堿溶液損傷血管內皮超極化因子(EDHF)介導的內皮依賴性舒張，增加了血管的張力;②其酸性pH 值(pH 5. 0)，會進一步損傷VEC 可引起抗血小板聚集，筆者實驗觀察到對血管的擴充及保護作用不如17β -雌二醇組。而自體血肝素混合組擴充血管為純暴力克服大隱靜脈痙攣，引起血管平滑肌局部釋放化學痙攣因子，內皮細胞大量脫落，內皮脫落，固有層細胞水腫明顯，肌層細胞出現黏液變性及肌纖維變性，通過筆者的實驗觀察血管損傷最大，這一點與國內外其他研究一致。

通過本研究透射點鏡觀察結果表明，應用17β -雌二醇作為擴充液擴充后的血管通過透射電鏡觀察藥物擴張后的大隱靜脈內皮細胞和平滑肌細胞超微結構各細胞器較為清晰、完整，罌粟堿組次之，自體血肝素混合組損傷最大。其原因除了17β -雌二醇上述舒血管機制減少細胞損傷外，還可能與雌激素通過誘導凋亡抑制基因bcl -2mRNA 表達，進而增加bcl-2 蛋白合成，誘導c-myc 編碼的蛋白質，抑制平滑肌增殖發生凋亡，筆者的實驗觀察到17β -雌二醇組細胞超微結構各細胞器較為清晰、完整。本實驗的電鏡結果顯示，酸性罌粟堿溶液損傷血管內皮細胞及血管內皮超微結構與文獻報道是一致的。另外通過本實驗發現利用透射電鏡結合對血管內皮細胞的超微結構展開研究，具有準確、直觀，既可定量又可定性研究的優點。

本實驗本實驗結果中發現，17β -雌二醇組作為擴充液擴充后的血管通過免疫組化(ICAM -1)檢測觀察陽性表達最少，ICAM -1 是目前認識的黏附分子主要有細胞間黏附分子-1，在多種血管性疾病病理變化，如炎癥有關的疾病、血管損傷性疾病以及缺血再灌注性損傷等多種病理條件下，皆可發生中性粒細胞與內皮細胞的黏附，其黏附正是由細胞表面的ICAM-1 等黏附分子介導的，且ICAM -1 在白細胞對內皮的緊密黏附中起關鍵作用，二者的結合導致中性粒細胞與內皮細胞黏附，成為內皮細胞損傷和功能障礙的基礎。中性粒細胞及內皮細胞在病理條件下，還可以釋放一些細胞因子，如TNF -α、IL -1 等，由此引起缺血后的炎癥反應。同時這些炎癥細胞因子又可以增加內皮細胞、中性粒細胞表面黏附分子的表達，促進二者的黏附，加重內皮細胞損傷。黏附的中性粒細胞還可以通過釋放一些彈性蛋白酶來損傷內皮細胞，同時，中性粒細胞的活化和穿入會引起組織的炎性損傷，會導致組織的重構。本實驗可以得出17β-雌二醇作為擴充液組血管ICAM -1 陽性表達最少，可以得到其對血管損傷最小，推測擴充液從理論上應增加橋血管遠期通暢性。

本課題應用17 -β 雌二醇作為擴充液與傳統擴充液在相同擴充壓力下對靜脈橋損傷的對應比較，結果發現在臨床中選取17 -β 雌二醇作為擴充液對大隱靜脈損傷最小，為其應用在臨床冠狀動脈旁路移植術中提供了理論依據，但其在臨床工作中保持橋血管通暢性的效果還需要臨床試驗進行論證及進一步研究。

1 Comelissem J. Mechanical stretch induces phosphorylation of P38 -mAPK and apoptosis in human saphenous vein［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(3):451 -456

2 Motwani JG，Topol EJ. Aortocoronary saphenous vein graft disease pathogenesis，predisposition，and prevention［J］. Circulation，1998，97(2):916 -931

3 Strehlow K，Werner N，Berweiler J，et al.Estrogen increases bone marrow - derived endothelial progenitor cell production and diminishes neointima formation［J］.Circlation，2003，107(8):3059 -3065

4 Kyriakides ZS，Petinakis P，Kaklamanis L，et al. Intramuscular administration of estrogen may promote angiogenesis and perfusion in a rabbit model of chronic limb ischemia［J］. Cardio Vascular Research，2001，49(3):626 -633

5 Martin-McNulty B，Tham DM，da Cunha V，et al. 17β-estradiol attenuates development of angiotensin Ⅱ-induced aortic abdominal aneurysm in apolipoprotein E - deficient nice thromb［J］. Vasc Biol，2003，23(4):1627 -1632

6 徐利，張心武，龐曉明.17β -雌二醇對大鼠血管平滑肌細胞c 反應蛋白及其mRNA 表達的影響［J］. 浙江大學學報:醫學版，2013，55(1):11 -16

7 董勇，李文志，辛毅.血管內皮生長因子和雌二醇促進血管內皮祖細胞分化生成血管的對比研究［J］.中國美容醫學，2013，23(3):102 -105

8 宋春莉，張基昌，李楊雪.雌二醇可降解涂層支架置入后對犬冠狀動脈內膜增生的影響［J］. 中國實驗診斷學，2011，(16)2:161 -164

9 Axford - Gatley RA，Wilson GJ，Feindel CM. Comparison of bloodbased and asanguineous cardioplegic solutions administered at 4 degrees C. An ultrastructural morpbometric study in the dog［J］.J Thborac Cardiovase Surg，1990，100(7):400 - 409

10 陳彤宇，陳長志 周嘉.4 種保存液對靜脈橋管收縮和舒張功能的影響［J］.陜西醫學雜志，2009，41(2):165 -167

11 何華.如何正確的對免疫組化結果進行半定量評分［J］.中外健康文摘-臨床醫師，2008，37(5):243 -246

12 Yavuz S，Celkan A，Goncu T. Effect of papaverine applications on blood flow of the internal mammary artery［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg 2001，45(7):84 -87

13 Harrison WE，Mellor AJ，Clark J.Vasodilator pre-treatment of human radial arteries comparison of effects of phenoxybenzamine vs papaverine on norepinephrine - induced contraction in vitro［J］. European Heart Journal，2001，22(8):2209 -2216

14 Liu Z，Liu X，Anthony PC，et al. Direct measurement of nitric oxide release from saphenous vein:abolishment by surgical preparation［J］.Ann Thorac Surg，2001，71(5):133 -137