miR-21 在乳腺癌患者血清中的表達及意義

王貴年 吳 娟

乳腺癌是目前全世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性身心健康及危害其生命。近年來研究表明，miRNA 功能失調與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，在細胞的增殖、凋亡、分化等過程中發揮重要作用，miRNA 成為腫瘤研究領域的熱點［1］。迄今，尚無miR -21 在乳腺癌患者血清中確切表達情況的研究報道。為此本研究擬通過檢測乳腺癌患者血清中miR-21 表達水平，重點探討血清miR-21與乳腺癌臨床病理特征之間的關系，為臨床診斷治療乳腺癌提供新的思路。

材料與方法

1.研究對象:隨機選取2012 年3 月～2013 年7 月淄博市第一醫院住院、門診乳腺疾病女性患者共49 例作為研究對象，其中乳腺良性腫瘤組23 例，患者年齡23 ～65 歲，平均年齡42.15 ±15.73 歲，乳腺浸潤性導管癌組26 例，年齡25 ～76歲，平均36. 24 ±29. 57 歲，(Ⅰ期9 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期6例)，所有研究對象均排除妊娠、感染、肝腎功能不全、糖尿病和心腦血管疾病等并發癥及無其他腫瘤等疾病。本研究中乳腺癌患者病例診斷參照美國癌癥聯合會第七版癌癥分期手冊(cancer staging manual)［2］，全部病例術前均未行化療或放療，內分泌治療。采集研究對象受試者空腹靜脈血3ml，3500r/min 離心5min，取血清于-20℃保存備用。

2.儀器及試劑:ABI Prism7000 熒光定量PCR 儀(Applied bio systems 公司);總RNA 提取試劑盒(QiaGen miReasy Mini Kit)購于德國QiaGen 公司;反轉錄試劑盒(U6 snRNA，PCR primer set，has-miR-21，LNATM PCR primer set);實時熒光定量PCR 試劑盒(Roche 公司)。

3.血清miR-21 檢測:(1)miR-21 及U6 snRNA 的反轉錄:按照總RNA 提取試劑盒說明書對所有標本操作，提取總RNA 后保存于-20℃冰箱中;按反轉錄試劑盒說明書，反轉錄前cRNA 總濃度稀釋為5ng/μl，反應條件:42℃水浴中溫育60min，合成cDNA 溫育完成后，將此離心管置于95℃空氣浴中加熱樣品5min 取出于-20℃保存。(2)SYBR Green -real-time PCR 法測定miR -21 表達:總反應體系20μl:SYBR Green Mix 9μl，miR - 21 forward primer 2μl，miRNA reverse primer 2μl，template cDNA 2μl，RNase - free H2O 5μl;qRT -PCR 反應條件:95℃20s 預變性;95℃10s、60℃20s，70℃10s采集熒光，40 個循環。以U6 snRNA 作為內參，并設置空白對照，所有標本反應均設有3 個重復。

4.統計學方法:應用SPSS 17.0 統計軟件分析，數據采用均數± 標準差(±s)表示，各實驗組血清miR -21 濃度比較用秩和檢驗(檢驗水準α =0.05);血清miR -21 表達水平與乳腺癌臨床病理特征之間的相關性，采用Fisher 精確檢驗;以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.實時熒光定量PCR 檢測結果:陽性曲線和研究對象血清miR-21 及U6 snRNA 的反應曲線呈標準S 型，陰性和空白對照反應曲線呈不規則型。U6 snRNA 在所有檢測標本中都有表達，其Ct 值在28.20 ±1.03，可作為本實驗的內參照，說明擴增效果滿意，實驗結果可靠。

2.乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR -21表達水平比較:以△Ct 表示標本miR -21 的表達量，ΔCt=(CtmiR-21-CtU6snRNA)，△Ct 越低說明miR -21表達量越高，檢測結果顯示血清miR -21 的表達量在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺浸潤性導管癌中表達量遞增，提示血清miR-21 可作為疾病進展的指標(表1)。

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達水平比較(△Ct，±s)

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達水平比較(△Ct，±s)

P 值為與對照組(乳腺良性腫瘤組)相比

分組 n miR-21(△Ct)P乳腺良性腫瘤組23 4.02 ±1.56Ⅰ期 9 2.11 ±1.02 0.009Ⅱ期 11 1.13 ±0.96 0.005Ⅲ期6 1.01 ±0.53 0.001

2.血清miR -21 的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系:26 例乳腺癌患者進行血清miR-21 定量檢測，基因表達變化倍數采用2-△△Ct法進行比較，得出miR-21 相對表達量，結果符合正態分布(P ＞0.05)，平均值為0.60 ±0.21，以miR -21 相對表達的平均值0.60 為界，將乳腺癌患者分為miR-21低表達組和高表達組。乳腺癌組患者血清miR -21相對表達量與其年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經統計學分析差異無統計學意義(P ＞0.05)，乳腺癌組患者血清miR -21 相對表達量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結轉移(P =0.021)經統計學分析差異有統計學意義，呈正相關(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 血清miR-21 的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(n)

討 論

近年來我國乳腺癌的病死率增長了38.91%，已成為對婦女健康威脅最大的疾病之一［3］。目前，缺少乳腺癌的理想血清分子診斷標志物，CA153 被作為乳腺癌療效的理想觀察指標，但不能作為乳腺癌早期診斷標志物［4］。外周血循環腫瘤細胞可用來判斷乳腺癌的轉移，但早期轉移因腫瘤細胞少而隱蔽，導致陽性率低，限制了其臨床應用。隨著基因分子水平檢測方法的深入研究，乳腺癌發病機制取得了部分進展，因此應用qRT-PCR 法適用于檢測乳腺癌的血清分子診斷標志物［5，6］。

miRNA 是近年來發現的一類長度為19 ～25 個核苷酸的非編碼RNA，通過與mRNA 的3'端非翻譯區(3'untranslated regions，UTRs)進行序列特異性的結合從而抑制基因的轉錄后表達。隨著對miRNA 研究的不斷深入，發現miRNA 作為一種新的基因調控機制，在腫瘤細胞增殖、分化等發揮重要作用，越來越多的研究發現miRNA 通過作用于下游基因參與了乳腺癌細胞增殖、凋亡、轉移侵襲及放化療抵抗等，在乳腺癌的發生發展中扮演著重要的角色［7］。

研究證明，miR -21 是單個基因編碼miRNA，編碼基因位于17q23.2，miR -21 在膠質瘤、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達升高，并能通過抑制PTEN、PDCD4、TIMP3、TMP -1、RECK、p53 等抑癌基因的翻譯過程參與調控多種惡性腫瘤的發生［8］。目前miR-21 已被證實在許多類型腫瘤中均表達異常，雖然已預測出許多miR -21 直接調控的靶基因，但僅部分臨床中得到證實。2008 年Chen 等通過不同的實驗發現miRNA 以一種非常穩定的形態存在于血清，血清miRNA 作為一種非損傷性檢查，在乳腺癌的診斷和預后判斷方面具有良好的應用前景。通過文獻分析，大量研究人員開始關注循環miR -21，認為血清中升高的miR -21 表達對惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤轉移、腫瘤進展、對治療的反應和預后等方面具有預測價值。研究者發現［9］，相對于健康成年女性人群，乳腺癌患者血清miR -21 顯著上升，miR -92a 顯著下降，研究成果表明，miR -21 可以作為乳腺癌診斷的血清分子標志物。

本研究通過應用熒光定量PCR 法對血清miR -21 表達水平的檢測發現乳腺癌組明顯高于乳腺良性腫瘤組，提示血清miR -21 可能會成為乳腺癌患者的診斷參考指標，與Kumar 等［10］研究結果一致。26例乳腺癌組患者血清miR -21 的檢測結果與乳腺癌臨床病理特征相關性初步探討，結果顯示血清miR - 21 的表達水平與乳腺癌患者年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經統計學分析差異無統計學意義(P ＞0.05)，乳腺癌患者血清miR -21 相對表達量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結轉移(P =0.021)經統計學分析差異有統計學意義，呈正相關(P ＜0.05)。

為了明確miR -21 與乳腺癌轉移的相關性，本研究應用熒光定量PCR 法檢測發現，乳腺癌患者血清miR -21 高表達不僅與乳腺癌的發生有關，而且其表達上調可能會導致淋巴結轉移，說明miR -21與乳腺癌的轉移具有相關性，miR-21 可能作為一個腫瘤轉移促進基因在乳腺癌的轉移中發揮一定的作用，以上均提示血清miR -21 有望成為未來乳腺癌診斷和治療的一個新的靶點。

綜上所述，血清miR -21 在乳腺癌診治方面的臨床應用價值存在爭議，因此，血清miR -21 作為乳腺癌潛在的重要分子診斷標志物，仍需大樣本的臨床研究支持，以證實血清miR -21 表達水平與乳腺癌患者臨床病理因素的相關性以及評價預后的臨床意義。

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2 Edge SB，Byrd DR，Compton CC，et al. AJCC Cancer Staging Manual［M］. 7th ed. New York:Spring，2009

3 謝碧琛，李國利.Wnt/ wnt 基因信號通路與乳腺癌［J］.中國生物化學與分子生物學報，2011，27(2):125 -129

4 葉蓓，柳光宇，陸勁松，等.常用的乳腺癌血清腫瘤標志物在早期診斷中的應用價值不高［J］.中國癌癥雜志，2009，19(10):807 -808

5 Van Schooneveld E，Wouters MC，Van der Auweral I，et al. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic)breast cancer and healthy volunteers ［J］. Breast Cancer Res，2012，14 (1):R34

6 Asaga S，Kuo C，Nguyen T，et al. Direct serum assay for MicroRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer［J］. Clinical Chemistry，2011，57(1):84 -91

7 Li M，Li J，Ding X，et al. MicroRNA and cancer［J］. AAPS J，2010，12(3):309 -317

8 楊旸，康春生.miRNA-21 與腫瘤相關研究新進展［J］. 中國腫瘤臨床，2011，38(6):357 -360

9 Si H，Sun X，Chen Y，et al. Circulating microRNA -92a and microRNA -21 as novel minimally invasive biomarkers for primary breast cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(2):223 -229

10 Kumar S，Keerthana R，Pazhanimuthu A，et al. Overexpression of circulating miRNA - 21 and miRNA - 146a in plasma samples of breast cancer patients ［J］. Indian J Biochem Biophys，2013，50(3):210 -214