慢性鐵過載鼠模型的研究概況

溫曉文 吳迪炯 葉寶東 羅赟飛 吳逢選 周郁鴻

鐵過載是由于機(jī)體內(nèi)鐵供給超過鐵的需要、鐵利用障礙、相關(guān)基因突變等原因而導(dǎo)致鐵在某些組織器官中貯存增加的病理現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載不僅常見于一些血液系統(tǒng)疾病，如原發(fā)性血色病、地中海貧血、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、原發(fā)性骨髓纖維化等疾病因長期輸血或疾病本身原因造成鐵過載，還廣泛涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等諸多方面疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、病毒性肝炎等［1］。過量的鐵不僅影響心、肝、胰腺等臟器功能和結(jié)構(gòu)，而且與血液系統(tǒng)造血紊亂密切相關(guān)，對機(jī)體有著十分重要的危害。而隨著鐵過載的研究深入，構(gòu)建鐵過載鼠模型，已經(jīng)是研究工作中不可缺少的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。現(xiàn)將慢性鐵過載鼠模型的研究作一綜述。

一、模型的復(fù)制方法

1.注射鐵劑法:采用皮下或腹腔給鼠注射右旋糖酐鐵或蔗糖鐵，超過機(jī)體對鐵所需，導(dǎo)致鐵在體內(nèi)沉積。動物出現(xiàn)精神萎靡，生長速率減慢，皮毛粗糙等變化。實(shí)驗(yàn)室檢查可見鐵含量指標(biāo)(如血清鐵、鐵蛋白、組織鐵等)增高，抗氧化應(yīng)激指標(biāo)(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素E 等)降低。該法是目前慢性鐵過載鼠模型造模中應(yīng)用最多的，其經(jīng)典模型是Bartfay 等［2］在20 世紀(jì)末所建立。該實(shí)驗(yàn)為以后的研究奠定了基礎(chǔ)，為其他研究者提供了借鑒。

在實(shí)驗(yàn)用鼠的選擇上，學(xué)者們尚未達(dá)到共識，故當(dāng)前造模所涉及的鼠品系較為雜亂，但大鼠以沙土鼠多見，小鼠以Balb/c 鼠為主。現(xiàn)階段尚無公認(rèn)的注射鐵劑法鐵過載鼠模型的報(bào)道，造模過程中，鐵劑劑量、注射頻率、注射時(shí)間等選擇上仍有差異［3］。文獻(xiàn)報(bào)道右旋糖酐鐵有“100mg/kg 隔天1 次×5 次”或“60mg/kg 隔天1 次×5 次”或“200mg/kg 每周1 次×10 次”等用法［4～7］。進(jìn)一步研究表明組織鐵濃度與注射鐵劑劑量呈正相關(guān)，血清鐵(serum iron，SI)含量主要受注射總時(shí)間影響［3］。在研究鐵劑劑量與肝內(nèi)氧自由基和維生素E 濃度的實(shí)驗(yàn)中，Karey 等［8］予小鼠腹腔注射不同總劑量的右旋糖酐鐵(100、200、400mg/kg)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，注射總劑量與肝臟鐵濃度、丙二醛(malondialdehyde1，MDA)呈正相關(guān)，而與血中維生素E 含量呈負(fù)相關(guān)。

2.羰基鐵法:羰基鐵法見于大量的原發(fā)性血色病慢性鐵過載模型中。該方法予鼠長期進(jìn)食富含羰基鐵的飼料，最終導(dǎo)致鐵在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)沉積，達(dá)到建模目的。Christelle 等［9］將Balb/cJ 小鼠分成4組，分別喂以含有0%、0.5%、1.5%、3%的羰基鐵的飼料，并在實(shí)驗(yàn)第2、4、8、12 個(gè)月處死每組部分小鼠，以觀察造模情況。研究發(fā)現(xiàn):肝臟鐵濃度隨著飼料中羰基鐵含量以及喂養(yǎng)時(shí)間的增加而增加;而肝細(xì)胞異常有絲分裂、肝纖維化只現(xiàn)于3%組。同樣，Beatrice等［10］實(shí)驗(yàn)表明，喂有含3%羰基鐵的飼料小鼠8 周后與正常組(喂以普通飼料)相比，肝臟鐵濃度(2078 ±810/139 ±12μg/g)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(24 ±5/18 ±2U/L)、肝臟與體重之比(6. 7% ± 0. 4% /4. 8% ±0.4%)均有明顯差異。基于以上認(rèn)識，目前研究者在羰基鐵含量的選擇上以3%為主，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，喂養(yǎng)時(shí)間上有4、8、12 周等區(qū)別［11］。由于喂養(yǎng)時(shí)間、鼠的品系、鼠齡等差異，故實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)鐵過載程度亦有所不同。

3. 基因剔除法:鐵代謝相關(guān)基因HFE、TfR2、HAMP 等變異，是導(dǎo)致原發(fā)性血色病發(fā)生的根本原因。HFE 基因C282Y 突變可以使HFE 分子不能與β2微球蛋(β2-microglobulin，β2m)結(jié)合，不能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，從而失去對轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的調(diào)節(jié)功能。過去研究顯示，缺乏β2m 的小鼠與原發(fā)性血色病類似的肝臟存在鐵過載。Santos 等［12］給β2m基因敲除小鼠和正常小鼠喂以普通飼料或含有2.5%的羰基鐵的飼料，2 或4 個(gè)月后，β2m 基因敲除小鼠肝臟鐵濃度顯著高于正常組，β2m 基因敲除小鼠喂以羰基鐵飼料后其鐵過載程度明顯大于單純基因敲除小鼠。他們的實(shí)驗(yàn)同時(shí)為兩種方法聯(lián)合的研究提供了可能。骨形態(tài)形成蛋白6 (bone morpho -genetic protein 6，Bmp6)通過調(diào)節(jié)hepcidin 水平，影響機(jī)體的鐵代謝［13］。Bmp6 基因剔除小鼠，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad1、Smad5、Smad8 水平明顯降低，hepcidin 合成減少，鐵在肝臟、胰腺、心臟、腎快速且大規(guī)模沉積［14］。而Majda 等［15］研究則進(jìn)一步表明，Bmp6 基因剔除小鼠存在視網(wǎng)膜鐵過載。

二、模型的評價(jià)方法

基于當(dāng)前缺乏診斷鼠鐵過載的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)上述方案達(dá)到造模目的時(shí)，評價(jià)模型的終點(diǎn)指標(biāo)的選擇及其范圍(表1)有所不同。在指標(biāo)選擇上除肝鐵濃度、血清鐵蛋白(serum ferritin，SF)、組織鐵染色即能直接反應(yīng)體內(nèi)鐵沉積程度的指標(biāo)外，還選擇能反應(yīng)氧化應(yīng)激的指標(biāo)如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶等，以及肝功能的指標(biāo)。后兩者的改變可繼發(fā)于鐵過載，故可間接反應(yīng)鐵過載。此外，從病理上看，鐵過載時(shí)肝細(xì)胞呈廣泛變性、點(diǎn)狀液化性壞死，或伴有輕微纖維化［11］;小鼠心外膜及心肌間質(zhì)均可見大量漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，心肌間質(zhì)可見出血、水腫等病理變化［16］;脾臟可出現(xiàn)小體萎縮，周圍及脾竇纖維組織增生，且隨著鐵過載含量增加，纖維化更加明顯;腎臟腎小球變小，腎小管擴(kuò)張內(nèi)見紅染無結(jié)構(gòu)物質(zhì)。

雖然前述的模型方法在造模過程中各有特點(diǎn)(或增加鐵負(fù)荷或?qū)е妈F代謝紊亂)，但它們均以鐵在組織過量沉積為最終效應(yīng)。故在模型評價(jià)上均應(yīng)以直接反應(yīng)體內(nèi)鐵濃度的指標(biāo)為基礎(chǔ)(如SI、SF、肝鐵濃度、組織鐵染色等)，輔以氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA、SOD、谷胱甘肽等)。筆者認(rèn)為肝是體內(nèi)鐵沉積的首要器官，肝鐵濃度能很好反應(yīng)體內(nèi)鐵沉積程度，是診斷人類鐵過載的金標(biāo)準(zhǔn)，其應(yīng)亦是診斷鼠鐵過載的金標(biāo)準(zhǔn)。然而各鼠有品系之別，鼠鐵過載時(shí)肝鐵濃度的數(shù)值確定還需進(jìn)一步探討。

表1 注射鐵劑法［4 ～7］和羰基鐵法［9］達(dá)到造模目的的相關(guān)指標(biāo)范圍

三、小 結(jié)

長期從胃腸攝入羰基鐵，不能很好模仿臨床繼發(fā)性鐵過載鐵在肝、脾、心等貯鐵器官的沉積及其毒性作用，故羰基鐵法主要用于原發(fā)性鐵過載模型的建立，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、病死率低，而缺點(diǎn)是造模周期長。注射鐵劑法被許多學(xué)者用于建立繼發(fā)性鐵過載模型，其具有復(fù)制周期短，成功率高，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢;基因剔除法只限于特異的基因研究，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，條件要求高。

筆者認(rèn)為以上3 種造模方法各有其適用范圍，然而具體到鐵過載肝、心、胰腺等臟器研究則缺少針對性，至今還無鐵過載鼠模型關(guān)于血液系統(tǒng)的研究。注射鐵劑法、羰基鐵法的應(yīng)用上，采用大劑量可以加深組織鐵沉積，而延長注射或喂養(yǎng)鐵的時(shí)間可使SI、SF維持高的濃度。鐵代謝相關(guān)基因如HFE、TfR2、HAMP 的剔除，從基因水平上驗(yàn)證該基因在鐵過載發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為鐵過載的研究提供新的思路。

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