α 干擾素增強骨肉瘤細胞對依托泊苷敏感性的實驗研究

黃秀芳 原向偉

1.廣東省江門市中心醫院病理科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫院骨科，廣東江門 529030

骨肉瘤高發于青少年人群，居于人類骨骼系統惡性腫瘤發病率第1 位，其惡性程度高，發展快，許多患者在發現時已存在肺轉移，因此療效不佳。 目前主要治療方法包括新輔助化療+外科手術包括保肢或截肢手術，但能否手術及保證手術效果的重要前提是化療有效。臨床上相當患者因為化療耐藥或毒副作用大等問題，引起化療失敗，導致患者無法行保肢手術從而截肢，甚至無法手術而導致死亡[1]。 因此，提高化療療效對于骨肉瘤的治療來講具有重大意義。IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素，具有調節免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學作用[2]，IFN-α 可直接抑制耐藥骨肉瘤細胞的生長[3]，然而其對骨肉瘤化療敏感性的影響目前尚不清楚。因此筆者聯合使用IFN-α 與依托泊苷（Etoposide）處理人骨肉瘤U2OS 和MG63 細胞，探討其對兩種細胞生長抑制和凋亡的影響，并研究其分子機制，以期為提高骨肉瘤對化療藥物敏感性提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人骨肉瘤細胞U2OS（p53 基因野生型）和MG63（p53 基因突變型）購自中山大學病理教研室，培養液為DMEM（GIBCO 產品），其中含10%胎牛血清（GIBCO 產品）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養于37℃的5%CO2培養箱（Forma，美國）。

1.2 藥物處理

IFN-α 購自Peprotech 公司， 批號300-02A，Etoposide 購自Sigma 公司， 批號E1383， 稀釋分裝凍存-20℃， 使用時采用DMEM 培養液稀釋成工作濃度，處理分為四組：對照組（加入與等量于其余組的DMEM 培養液）、IFN-α （加入含工作濃度藥物的DMEM 培養液使終濃度為5000 U/mL） 組，Etoposide（終濃 度 在U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG63 細 胞 為0.625 μg/mL）組和IFN-α＋Etoposide（終濃度同上）組。

1.3 流式細胞術檢測

細胞經處理后， 消化離心， 收集細胞；PBS 洗兩次，離心；70%乙醇固定過夜；細胞經10 μmol/L 的碘化丙啶（PI）染色5 min，4℃避光30 min；上FCM 流式細胞儀（BD，美國）用488 nm 激發光檢測細胞DNA含量，LYSIS 軟件分析凋亡率。

1.4 DNA Ladder 檢測

細胞經各處理后，消化離心，收集細胞；PBS 洗兩次；加入0.8 mL 的DNAzol（Invitrogen 產品，批號：10503-027），室溫放置數分鐘；4℃離心15 min；將上清移入新EP 管， 加入0.4 mL 的無水乙醇；4℃離心10 min；棄上清，加入75%乙醇洗2 次，加入適量TE 溶解基因組DNA，在含有EB 的1.8%瓊脂糖凝膠電泳（水平電泳槽為北京六一廠產品），紫外線激發，凝膠成像分析儀（Bio-Rad，美國）采集DNA 梯形條帶。

1.5 Western blot

收集細胞，PBS 清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA 法），SDS-PAGE 電泳（垂直電泳儀為美國Bio-Rad 產品），然后電轉至PVDF 膜（電轉儀為美國Bio-Rad 產品），將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，4℃過夜； 鼠抗人p53、MDM2、Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體和兔抗人PARP 多克隆抗體均為SantaCruz公司產品，稀釋后室溫封膜3 h 或4℃過夜，二抗稀釋后室溫封膜1 h 或4℃過夜， 暗室ECL 化學發光，膠片顯影，定影。

1.6 統計學方法

采用SPSS 14.0 軟件進行統計分析， 計數資料以率表示，組間比較采用q 檢驗。 以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞對Etoposide 引起凋亡的影響

U2OS 和MG63 細胞經IFN-α （5000 U/mL）和etoposide（U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG6 細 胞 為0.625 μg/mL）單獨或聯合處理72 h 后進行流式細胞術檢測凋亡率,流式細胞術結果顯示，U20S 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 的細胞凋亡率分別為：（5.1±2.3）%、（5.7±2.7）%、（15.3±3.8）%和（45.5±5.2）%（圖1A），結果表明IFN-α 單獨并不誘導明顯的U2OS 細胞凋亡，卻明顯增強了Etoposide 誘導的U2OS 細胞凋亡，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。然而同樣處理MG63 細胞后結果顯示，MG63 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 組的細胞凋亡率分別為：（2.2±0.8）%、（2.5±1.1）%、（23.8±4.6）%和（24.9±5.3）%（圖1B），表明IFN-α 不僅單獨不誘導明顯的MG63 細胞凋亡， 也無增強Etoposide 誘導的MG63 細胞凋亡的作用，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。

圖1 流式細胞術檢測α 干擾素對依托泊苷誘導的U2OS 和MG63細胞凋亡的影響

2.2 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞中對“DNA 梯形條帶”的影響

U2OS 和MG63 細胞經IFN-α （5000 U/mL）和etoposide （U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL，MG6 細 胞 為0.625 μg/mL）單獨或聯合處理72 h 后進行DNA Ladder 電泳。 DNA Ladder 是凋亡的特征性表現，結果顯示， 與其他各組相比，IFN-α/Etoposide 組的U20S 細胞出現明顯的梯形條帶（圖2A）；而在MG63 細胞，各組均未出現明顯梯形條帶（圖2B）。 表明IFN-α 可明顯增強Etoposide 誘導的骨肉瘤細胞凋亡， 并且這種效應僅出現在p53 功能正常的U2OS 細胞中，而在因突變導致p53 功能喪失的MG63 細胞中無此效應，提示了p53 可能參與此效應。

圖2 DNA 梯形條帶分析α 干擾素對依托泊苷誘導的U2OS 和MG63 細胞凋亡的影響

2.3 IFN-α 在U2OS 細胞中對Etoposide 引起PARP活化的影響

U2OS 細胞經IFN-α （5000 U/mL） 和etoposide（2.5 μg/mL）單獨或聯合處理72 h 后進行western blot檢測PARP 蛋白活化。 采用Western blot 法檢測凋亡關鍵酶PARP 的裂解，結果表明，在U2OS 細胞，對照組、IFN-α 組和Etoposide 組均未出現PARP 的活化，在聯合用藥組可見116 KD 的無活性PARP 前體明顯裂解為85 KD 的活化片段（圖3）。提示聯合用藥明顯增強PARP 活化，從而觸發U2OS 細胞凋亡。

圖3 α 干擾素在U2OS 細胞中增強依托泊苷誘導的PARP 裂解活化（Western blot 法）

2.4 IFN-α 對Etoposide 活化p53 凋亡通路的影響

為進一步驗證IFN-α 對Etoposide 的增敏作用與野生型p53 的功能有關，筆者進一步檢測了p53 凋亡通路相關基因p53、Bax、Bcl-2、Mdm2 等的表達。如圖4所示， 在U2OS 細胞中，IFN-α 單獨對p53 及其靶基因MDM2 的表達無明顯影響， 而Etoposide 可明顯增強二者的表達， 聯合用藥則進一步增高二者的表達。Bax 和Bcl-2 均是p53 的下游調控基因， 促凋亡的Bax 的表達被Etoposide 增高， 并被IFN-α+Etoposide進一步增強；與對照組相比，抗凋亡的Bcl-2 的表達雖然在Etoposide 組無變化，卻被聯合用藥明顯減弱。因此p53、Bax、MDM2 和Bcl-2 的表達變化與凋亡保持同步， 提示了在IFN-α 通過激活p53 凋亡通路增強Etoposide 誘導U2OS 細胞凋亡。 然而在MG63 細胞中，上述基因的蛋白表達均無明顯變化，與MG63細胞中的陰性結果相符合。

圖4 IFN-α 在U2OS、MG63 細胞中對Etoposide 誘導p53，Bax，Mdm2 和Bcl-2 表達的影響（Western blot 法）

3 討論

干擾素是一類多功能細胞因子， 具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種生物學作用[1]，包括Ⅰ型和Ⅱ型， 其中IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素， 可與細胞表面的IFN-α/β 受體結合， 從而引起JAK1 和TYK 的活化，活化的JAK1 和TYK 可分別使STAT1 發生和酪氨酸位點（Tyr701）和絲氨酸位點（Ser727）的磷酸化，磷酸化的STAT1 蛋白形成同源或異源二聚體， 進入細胞核與其靶基因啟動子上的干擾素刺激反應元件或者γ 活化序列結合，進而調控下游基因表達[4]。 IFN-α 也是臨床治療腫瘤的第一種細胞因子， 已用于膀胱癌、腎癌、肝癌、白血病的臨床治療[5]。

以依托泊苷、阿霉素、順鉑等DNA 損傷性藥物為代表的傳統化療藥物已廣泛用于人類骨肉瘤的新輔助化療，并獲得一定療效，但因其無腫瘤靶向特異性，常常在殺滅腫瘤細胞的同時也破壞正常組織細胞，從而帶來嚴重的毒副作用，最終導致化療的失敗并影響骨肉瘤的最終療效[6-7]。 有研究表明IFN-α 本身即可抑制多藥耐藥的骨肉瘤細胞生長[3]，那么IFN-α 聯合化療藥物對骨肉瘤細胞的生長是否存在協同作用，筆者對此進行了一系列研究。

CAD（caspase activated DNAase）是細胞中一種能切割染色質的核酸酶， 可被caspase-3 激活，CAD 可識別DNA 序列中的特定位點，將細胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷，從而形成180～200 bp或其整數倍大小的寡核苷酸片段， 經瓊脂糖凝膠電泳會出現梯形電泳條帶，是凋亡的特征性表現，因而成為鑒定凋亡的經典指標[8]。 筆者從流式細胞術和形態學兩方面證明IFN-α 對U2OS 細胞無明顯影響，卻明顯增強Etoposide 誘導凋亡， 提示二者聯用比化療藥物單用具有更好的抗癌作用。 并且，在U2OS 細胞中，聯合用藥可明顯增強PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]的活化。實際上，PARP 是反映凋亡的經典指標，受到促凋亡信號的刺激后，細胞內蛋白酶Caspases 家族成員caspase 8、9 被激活， 繼而激活下游效應性caspase 3，最終裂解其底物PARP 發生活化，最終導致細胞凋亡[9]。 上述變化在p53 基因突變而喪失功能的MG63 細胞中卻沒有發生，這提示此效應可能與p53 有關。 p53 是一個經典的抑癌基因，在超過50%的惡性腫瘤包括骨肉瘤中都存在缺失或突變， 與腫瘤的發生發展關系密切[10]， 作為凋亡調控的主要靶點， 激活的p53 可通過調節其下游基因如MDM2，Bax、Bcl-2 等的轉錄和表達，誘導細胞走向凋亡[10]。 目前，p53 已被認為是眾多化療藥物（包括Etoposide）抗癌作用的主要介導者[7]。 不僅如此，最近研究表明，p53 也參與了IFN-α 引發的信號通路[11]。 筆者發現，Etoposide 激活了p53 及其下游基因如MDM2、Bax 等的表達。 IFN-α 雖然單獨應用對p53 通路無明顯影響， 卻明顯增強Etoposide 引起的p53、Bax 和MDM2的表達，同時減弱了Bcl-2 的表達，充分說明IFN-α通過激活p53 依賴性信號通路增強Etoposide 誘導的U2OS 細胞凋亡。

MDM2 基因是調節p53 的一個重要因子， 它在細胞核中直接與p53 結合，抑制其轉錄活性，并通過胞核-胞漿穿梭將p53 轉運至胞漿并使其降解，從而降低p53 水平；另一方面，p53 的上調可激活MDM2轉錄表達，來反饋性抑制p53 蛋白的繼續增高。如此二者形成一個負反饋調節環， 使細胞內MDM2/p53比率保持恒定[12]。 本研究發現聯合用藥引起的p53上調伴隨著MDM2 水平的升高，表明p53 的上調反饋性地激活了MDM2 的表達，使其水平升高。Bax 和Bcl-2 基因同屬Bcl-2 家族， 均為p53 的靶基因，表達于線粒體，是調控細胞凋亡的重要基因[13]。二者功能相互拮抗，Bax 具有促進凋亡的作用，Bcl-2 則具有抗凋亡的作用， 二者的比例決定了細胞是否走向凋亡[14-16]。 而聯合用藥通過激活p53 上調Bax 和下調Bcl-2，使Bax/Bcl-2 比例增高，從而促使細胞發生凋亡。

因此，IFN-α 可通過誘導p53 依賴性凋亡來增強骨肉瘤U2OS 細胞對依托泊苷的敏感性，提示IFN-α與骨肉瘤傳統化療藥物聯合應用可望成為提高骨肉瘤化療療效的新方向。

[1] De Saint SN，Fletcher CD.Soft-tissue sarcomas：a update[J].Eur J Surg Oncol，1999，25（2）：215-220.

[2] Prejean C，Colamonici OR.Role of the cytoplasmic domains of the type I interferon receptor subunits in signaling [J].Semin Cancer Biol，2000，10（2）：83-92.

[3] Manara MC，Serra M，Benini S，et al. Effectiveness of Type I interferons in the treatment of multidrug resistant osteosarcoma cells [J]. Int J Oncol，2004，24（2）：365-372.

[4] Stark GR，Kerr IM，Williams BR，et al. How cells respond to interferons[J].Annu Rev Biochem，1998，67（3）：227-264.

[5] 郭子文，許曉軍.干擾素輔助小劑量HA 方案治療慢性粒細胞白血病29 例療效觀察[J].中國醫藥導報，2012，9（3）：37-38.

[6] Bruland OS，Pihl A.On the current management of osteosarcoma. A critical evaluation and a proposal for a modified treatment strategy [J]. Eur J Cancer，1997，33（11）：1725-1731.

[7] Hande KR. Etoposide：four decades of development of a topoisomerase II inhibitor [J]. Eur J Cancer，1998，34（10）：1514-1521.

[8] Gavrieli Y，Sherman Y，Ben S.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation [J]. J Cell Biol，1992，119（3）：493-501.

[9] Smulson ME，Simbulan-Rosenthal CM，Boulares AH，et al.Roles of poly（ADP-ribosyl）ation and PARP in apoptosis，DNA repair， genomic stability and functions of p53 and E2F-1 [J]. Adv Enzyme Regul，2000，40（2）：183-215.

[10] 何均輝，鄒秀玲，李忠楚，等.p53 蛋白在胃癌中的表達分析[J].中國醫藥導報，2012，9（5）：86-88.

[11] Porta C，Hadj SR，Nejmeddine M，et al.Interferons alphaand gamma induce p53-dependent and p53-independent apoptosis， respectively [J]. Oncogene，2005，24（4）：605-615.

[12] Moll UM，Petrenko O. The MDM2-p53 interaction[J]. Mol Cancer Res，2003，1（14）：1001-1008.

[13] Bond J，Haughton M，Blaydes J，et al. Evidence that transcriptional activation by p53 plays a direct role in the induction of cellular senescence[J].Oncogene，1996，13（10）：2097-2104.

[14] Cory S，Adams JM.The Bcl2 family： regulators of the cellular life-or-death switch[J].Nat Rev Cancer，2002，2（9）：647-656.

[15] 黃鳳，毛麗松，張佳.Bcl-2、IGF-2 蛋白在子宮肌瘤組織中的表達及其相關性研究[J].中國現代醫生，2013，51（13）：13-14.

[16] 王婷，馬云.Bcl-2 在三陰性乳腺癌中的預后價值[J].中國現代醫生，2012，50（29）：44-46.