高效液相色譜法同時測定大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量

韓成花 白玉華 于春月 高賽男 楊璐銘

哈爾濱醫科大學（大慶），黑龍江大慶 163319

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，又名長壽菜、馬齒菜、酸莧、五行草、長命菜、螞蟻菜、醬板菜、酸味菜等，夏、秋二季采收，除去殘根和雜質，洗凈，略蒸或燙后曬干[1]。馬齒莧性酸味寒，具有清熱利濕、涼血解毒的功效。馬齒莧營養豐富，含有大量蛋白質、鈣、磷、鐵、氨基酸、維生素等營養成分，還含有有機酸類、黃酮類、生物堿類、萜類、香豆素類等化學成分，是夏季人們喜愛的野生植物之一，而且現代藥理研究表明馬齒莧具有降血脂、降血糖、抗衰老、消炎抑菌、增強免疫等多種保健功能和治療疾病的作用[2-3]，是藥食兩用的植物。

馬齒莧對生長環境要求較低，耐旱、耐澇、抗寒，生活力極強，在大慶的鹽堿地也能生長，主要生于菜園、農田、路旁等地。 大慶地區大多為鹽堿地，若能種植中藥馬齒莧，即充分利用了大慶的資源，也能改善生態環境，也會為大慶地區帶來巨大的經濟效益和社會效益。

山奈酚和槲皮素為馬齒莧的主要成分，測定其含量對控制該藥材質量具有重要意義。本研究通過高效液相法同時測定大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量，為大慶地區馬齒莧的開發利用提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KH3200DE 超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司），ESJ200-4 電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司），Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試劑

蘆丁、槲皮素、山奈酚對照品購自北京世紀奧科生物技術有限公司，馬齒莧采自大慶市薩爾圖區，經哈爾濱醫科大學（大慶）藥學院白玉華教授鑒定。 甲醇為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司），純凈水（吉林娃哈哈飲用水有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品和對照品溶液的制備

精密稱取大慶地區馬齒莧藥材粉末0.5102 g，加入甲醇50 mL，超聲提取[4-5]（功率80 W，頻率20 kHZ，溫度40℃）1 h 后，過濾，濾液轉移到50 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，使混勻，過微孔濾膜（0.45 μm），即為樣品溶液。

精密稱取槲皮素對照品0.0062 g 以及山奈酚對照品0.0056 g，置于25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為混合對照品溶液。

2.2 高效液相色譜條件的選擇[5-15]

色譜條件：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）P/N993967-902 為色譜柱；流動相為甲醇-0.2%磷酸（45∶55）；檢測波長360 nm；柱溫25℃；流速1.0 mL/min。在此色譜條件下，混合對照品溶液（圖1）中槲皮素和山奈酚的分離度好，大慶馬齒莧樣品溶液色譜圖（圖2）與混合對照品溶液色譜圖中槲皮素和山奈酚的保留時間一致。 因此，上述色譜條件可用于同時檢測大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 大慶馬齒莧樣品色譜圖

3 結果

3.1 繪制標準曲線

準確吸取適量的混合對照品溶液，進樣量分別為0、2、4、6、8、10 μL，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制槲皮素的標準曲線：Y=1083.9X-8.0567，r = 0.9997，在0.496～2.480 μg 范圍內線性關系良好（圖3）。 以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制山奈酚的標準曲線：Y=860.95X-16.472，r = 0.9997，在0.448～2.240 μg 范圍內線性關系良好（圖4）。

圖3 槲皮素標準曲線

圖4 山奈酚標準曲線

3.2 精密度測試

精密吸取混合對照品溶液，進樣5 次，每次10 μL，測得槲皮素的峰面積RSD=0.30%，山奈酚的峰面積RSD=0.28%，顯示儀器的精密度良好。

3.3 穩定性測試

精密吸取同一樣品溶液，在0、2、4、6、8、10、12 h 的時間間隔內分別進樣10 μL，測定峰面積，槲皮素的峰面積RSD 分別為0.10%、0.10%、0.12%、0.21%、0.21%、0.33%，山奈酚的峰面積RSD 分別為0.14%、0.08%、0.14%、0.14%、0.16%、0.24%，說明在12 h 內樣品穩定可靠。

3.4 重復性測試

測得槲皮素的平均含量為0.0395%，RSD=2.50%，山奈酚的平均含量為0.0483%，RSD=3.01%，表明此方法的重復性良好（表1）。

表1 HPLC 法的重復性實驗結果

3.5 加樣回收率實驗

槲皮素的平均回收率為98.10%，RSD = 0.45%（表2），山奈酚平均回收率為96.90%，RSD = 0.63%（表3）。 該方法穩定、可靠，可用于大慶地區馬齒莧黃酮類化合物含量測定。

表2 HPLC 法槲皮素回收率實驗結果

表3 HPLC 法山奈酚回收率實驗結果

3.6 樣品的測定

取3 份馬齒莧藥材，按“2.1”項下制備樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定槲皮素和山奈酚的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果

4 討論

本實驗是在研究大慶馬齒莧總黃酮含量測定方法（用以槲皮素為對照的AlCl3顯色法）的基礎上，為進一步完善大慶馬齒莧質量標準，做了高效液相色譜法測定馬齒莧中黃酮類化合物的研究。相關文獻中也表明馬齒莧中主要含游離黃酮類化合物如： 槲皮素、山奈酚等化學成分[5]。 因此本實驗用高校液相法同時測定大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量，其高效液相的色譜條件和樣品、對照品溶液的配制參考了相關文獻[5-15]并進行了反復的摸索，最終確定了最佳的實驗條件：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；流動相為甲醇-0.2%磷酸（45∶55）；檢測波長360 nm；柱溫25℃；流速1.0 mL/min。

大慶馬齒莧中黃酮含量比其他文獻[5]中的黃酮含量高，說明大慶馬齒莧藥材質量較好，利用荒廢的鹽堿地大量人工栽培馬齒莧，能將為大慶帶來巨大的經濟效益。

本實驗采用高效液相色譜法同時測定大慶馬齒莧中山奈酚和槲皮素的含量，并通過方法學考查探討了方法的可行性。此方法靈敏度高，精確度高，分離效能高，可以成為測定大慶地區馬齒莧中山奈酚和槲皮素含量的理想方法。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出社，2010：46-47.

[2] 杜建華.中藥馬齒莧的藥用價值和營養價值[J].中國現代藥物應用，2010，4（19）：223-224.

[3] 丁懷偉，姚佳琪，宋少江.馬齒莧的化學成分和藥理活性研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2008，25（10）：831-838.

[4] 趙進，劉嬌，羅建華，等.超聲波提取百色馬齒莧總黃酮及其鑒別[J].時珍國醫國藥，2007，18（7）：1714-1715.

[5] 王錦軍，楊成雄.馬齒莧中黃酮化合物的高效液相色譜分析[J].解放軍藥學學報，2010，26（4）：345-347.

[6] 潘曉軍，呂圭源，陳素紅，等.RP-HPLC 同時測定白花木花中的槲皮素和山奈酚[J].光譜實驗室，2012，29（3）：1717-1720.

[7] 黃志勤，程齊來，李洪亮.RP-HPLC 測定細梗胡枝子中3種黃酮類有效成分[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：70-72.

[8] 李丹，楊冉，曾華金，等.RP-HPLC 同時測定金錢通淋顆粒中槲皮素、木犀草素及山奈酚的含量[J].鄭州大學學報：醫學版，2010， 45（1）：145-147.

[9] 梁臣艷，甄漢深，馬雯芳，等.高效液相色譜法測定廣西余甘子葉中槲皮素和山奈酚的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（8）：41-43.

[10] 代光秀.高效液相色譜法測定羅布麻茶中槲皮素的含量[J].中國中醫藥信息雜志，2008，15（5）：52-53.

[11] 郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC 測定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013， 19（11）：75-78.

[12] 孟憲波.HPLC 測定鳳眼草中槲皮素與山柰素的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（8）：77-79.

[13] 潘治峰.山奈酚的含量測定[J].醫學信息，2013，（25）：485.

[14] 陳海霞，劉向紅，梁宏臣.HPLC 法測定煙臺柴胡中蘆丁和槲皮素的含量[J].安徽農業科學，2013，41（8）：3382-3479.

[15] 覃蘭芳，胡琦敏，賴茂祥，等.HPLC 同時測定小蠟樹葉中槲皮素與山奈素的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：107-109.