雷公藤內酯對海人酸致癇大鼠腦海馬區水通道蛋白4表達的影響

王 嘉 覃尚珠 曾常茜 李 坤 丁 寧▲

1.大連醫科大學附屬第一醫院普外科，遼寧大連 116011；2.大連大學醫學院生物化學教研室，遼寧大連 116600

癲癇是常見的腦部慢性疾病，以大腦神經元突發 性異常放電導致的短暫大腦功能障礙為特征。在我國有20%～25%的癲癇患者常規藥物治療得不到有效控制，成為社會家庭的沉重負擔。 雷公藤內酯是近來神經退行性疾病臨床治療研究的熱點藥物之一，對老年性癡呆（Alzheimer's disease，AD）、帕金森病（Parkinson diease，PD） 和多發性硬化癥 （multiple sclerosis，MS）等具有神經保護作用[1]。雷公藤內酯對于癲癇的治療研究也取得了一定的進展[2-3]。目前在哺乳動物體內已發現13 種水通道蛋白（AQPs），其中水通道蛋白4（AQP4）在中樞神經系統內廣泛分布，與癲癇發病的電生理學機制、癲癇持續狀態及難治性癲癇腦損傷等機制密切相關[4]。 本實驗觀察了雷公藤內酯對海人酸致癇大鼠腦海馬AQP4 蛋白表達的影響，為雷公藤內酯應用于臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

10 周齡SD 雄性大鼠30 只，體重（230±10）g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。免抗AQP4 多克隆抗體購自Santa Cruz Technology 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體購自北京中杉金橋公司；RIPA 蛋白裂解液購自南京凱基生物科技發展有限公司；BCA 蛋白定量及ECL 發光試劑盒購自碧云天生物公司；Trizol及RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物公司；雷公藤內酯購自北京優尼康公司；海人酸購自Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及藥物注射 SD 大鼠分成三組：對照組、海人酸組、雷公藤內酯干預組，各10 只。稱取記錄大鼠重量后，海人酸組頸內皮下注射海人酸，劑量為10 mg/kg；雷公藤內酯干預組在海人酸注射前連續7 d腹腔內注射雷公藤內酯，劑量為30 μg/kg；對照組注射等量的生理鹽水。 造模后觀察動物的行為變化。

1.2.2 海馬組織取材及保存 致癇后第1 天取腦海馬組織，10%水合氯醛（350 mg/kg）皮下深麻醉后，在冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中取出全腦，由矢狀線切開，去除小腦及間腦，沿穹隆分離側腦室，去除外側壁的腦組織，將海馬從剩余腦組織上剝離，包于干凈錫紙中，標記后快速投入液氮中浸透，各組標本收集齊后從液氮轉到-70℃低溫冰箱凍存。

1.2.3 Western blot 法檢測AQP4 蛋白表達 取材方法同“1.2.2”項下，準備好冰盒將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預冷勻漿器中，勻漿的同時加入RIPA 蛋白裂解液（含PMSF100 μmol/L），然后12 000 r/min 離心15 min 除沉淀，BCA 蛋白定量后分裝凍存。各泳道取60 μg 樣品上樣后進行SDS-PAGE 電泳，轉膜。5%BSA 中4℃過夜封閉后用一抗（免抗AQP4 多克隆抗體1∶400，兔抗GAPDH 單抗1∶400）孵育2.5 h。 而后TBST 清洗3 次，每次10 min。繼之以HRP 標記的二抗（山羊抗兔IgG 抗體1∶1000 稀釋）37℃孵育1 h 后TBST 清洗5 次，每次10 min。 最后于暗室ECL 發光經顯影、定影后檢測目的條帶。膠片掃描后用Quantity One 軟件分析灰度值。

1.2.4 RT-PCR 法檢測AQP4 基因表達 取材方法同“1.2.2”項下，將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預冷勻漿器中，加入1 mL Trizol 勻漿至肉眼看不見組織顆粒，轉移至1.5 mL EP 管中，加200 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）劇烈振蕩，混勻30 s，4℃12 000 r/min 離心5 min，取上清300～400 μL 加等體積異丙醇，冰上放置5 min 后4℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清。 沉淀加75%乙醇1 mL，12 000 r/min 離心5 min， 棄上清，沉淀干燥。加20 μL DEPC 水溶解。紫外分光光度計測A260和A280并計算濃度。 將1 μg 總RNA 用反轉錄試劑盒反轉成cDNA，反應條件為42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min；1 個循環后用AQP4 上游引物5′-GTCCTCATCTCCCTTTGCTTT-3′，下游引物5′-GACTCCCAATCCTCCAACCAC-3′。管家基因GAPDH上游引物5′-TCCCACTCTTCCACCTTC-3′，下游引物5′-CTGTAGCCGTATTCATTGTC-3′分別進行特異性擴增，反應條件優化為94℃2 min，1 個循環；94 ℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，30 個循環；72℃10 min，1 個循環。反應結束后取10 μL 產物瓊脂糖電泳檢測表達量的變化。 凝膠成像儀照相并用Quantity One 軟件分析測定灰度值。

1.3 統計學方法

采用SSPS 11.5 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物海馬區AQP4 蛋白表達水平變化

Western blot 結果顯示，海人酸組與對照組AQP4條帶與GAPDH 條帶的灰度值比分別為0.872±0.141和0.453±0.078，海人酸組AQP4 表達顯著增多（P <0.05）；雷公藤內酯干預組中海馬AQP4 蛋白相對灰度值比為0.647±0.185，較對照組增多（P < 0.05），較海人酸組AQP4 表達顯著減少（P < 0.05）。 見圖1。

2.2 各組動物海馬區AQP4 mRNA 表達水平變化

RT-PCR 結果顯示，海人酸組與對照組AQP4 條帶與GAPDH 條帶的灰度值比分別為1.212±0.115 和0.843±0.091，海人酸組AQP4 mRNA 表達與對照組比較顯著增加（P<0.05）；雷公藤內酯干預組AQP4 mRNA相對灰度值比為1.105±0.192，與對照組相比，表達顯著增加（P < 0.05），與海人酸組相比，AQP4 mRNA 表達水平顯著減少（P < 0.05）。 見圖2。

圖1 雷公藤內酯對大鼠海馬區水通道蛋白4 表達的影響

圖2 雷公藤內酯對大鼠海馬區水通道蛋白4 mRNA 水平的影響

3 討論

癲癇是常見的神經系統多發病之一，全世界癲癇患者總數達3000 萬人，且我國每年有45 萬新增患者，總數約650 萬[5]，其中約有1/4 的患者治療后不能有效控制發作，轉為難治性癲癇；而約有2/3 的難治性癲癇為顳葉癲癇。顳葉癲癇的臨床特征是反復出現的自發性癲癇發作，最明顯的病理改變是海馬組織硬化，病情進展迅速，預后極差。 因此積極尋求高效、安全、毒副作用小的抗癇新藥及治療新靶點已成為臨床及基礎研究的重中之重。

雷公藤內酯是從雷公藤中分離出來的單體，毒性較小。 它可以透過血腦屏障，在神經系統疾病治療中發揮抗炎及免疫調節作用。 大量研究顯示，雷公藤內酯可以抑制膠質細胞的活化，減少炎癥因子及促炎癥細胞因子的釋放，對神經元具有明確的保護作用[5-6]，但其對水通道蛋白家族作用的分子機制方面研究報道較少。

AQP4 是大腦內的主要水通道蛋白，在軟腦膜、室管膜、脈絡叢及海馬、視上核、下丘腦等均有顯著的表達[7]。 AQP4 在神經系統主要有控制腦內水分的流動，易化星形膠質細胞的遷移，改變神經系統的興奮性等作用，參與了腦缺血、顱內感染、腦腫瘤以及神經退行性疾病等多種神經系統疾病的病理學過程。 AQP4 在癲癇治療中的作用一直是研究熱點，Binder 等[8]發現AQP4 敲除可提高癲癇發作的閾值，提示神經膠質的AQP4 可能參與了腦興奮性活動的調節。 在對海馬硬化的中央顳葉癲癇患者的研究中發現，硬化海馬中水含量增多。 通過采用定量RT-PCR 分析、免疫組織化學和高通量免疫金標記的方法檢測發現，硬化的海馬中AQP4 表達明顯上調[9]。腹腔注射鋰-匹羅卡品建立SD 大鼠癲癇持續狀態模型，在6、12、24、48、72、96、120、168 h 分別用免疫組化和RT-PCR 方法檢測AQP4 的表達，結果顯示癲癇持續狀態24 h 后腦組織AQP4 的蛋白和mRNA 表達水平明顯增高，48 h 達到高峰，持續72 h 后下降，并且AQP4 的動態表達變化和腦水腫形成過程呈正相關[10]。 以上研究說明AQP4與癲癇疾病的發生發展關系密切，AQP4 很可能成為癲癇治療研究的新靶點。

本實驗采用大鼠皮下注射海人酸方法建立了大鼠癲癇模型，它是研究難治性癲癇發病機制及藥物治療的良好模型。RT-PCR 和Western blot 結果均表明，海人酸組中海馬AQP4 蛋白和mRNA 表達水平比對照組顯著增多（P ＜0.05），與Alvestad 等[11]報道一致。進一步用雷公藤內酯干預發現，海馬區AQP4 蛋白和mRNA 表達水平比海人酸組顯著減少（P ＜0.05）。 結果提示，雷公藤內酯可下調AQP4 蛋白和mRNA 的表達，可以作為臨床治療難治性癲癇的候選藥物之一。但是雷公藤內酯對其下調的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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