腎臟中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的表達與肝硬化時腎功能的關系

張江國 龔鳳云 李 玲 宋建新▲

1.華中科技大學附屬同濟醫院感染科，湖北武漢 430030；2.武漢市普愛醫院，湖北武漢 430030

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）是脂質運載蛋白家族中的一個新成員，最初被發現能結合細菌鐵載體進而阻止鐵元素吸收入細菌從而抑制細菌活性[1]。近幾年，有學者發現高劑量腹腔內注射能引起腎小管壞死的順鉑，能快速誘導腎臟NGAL 的表達及從腎小管細胞釋放[2]。 也有學者報道指出腎小管在短時間缺血損傷后腎小管會高表達NGAL[3]。 腎臟NGAL 的表達是腎移植時腎臟缺血損傷的早期指標[4]。 肝硬化時腎功能受損及肝腎綜合征時，血和尿中NGAL 表達增多是腎功能受損的敏感指標[5-6]。但是在肝硬化腎功能受損時，NGAL 在腎臟的表達及與腎功能受損之間的關系還不是很清楚，因此本研究初步研究了大鼠肝硬化模型中腎臟NGAL 的表達與腎功能損害之間的關系。這將為腎臟NGAL 表達變化與肝硬化腎臟損傷之間的關系提供直接的證據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

雄性SD 大鼠60 只，SPF 級，體重150～200 g，購于自湖北省實驗動物中心，飼養于同濟醫院實驗動物中心SPF 級屏障環境。四氯化碳購自天津德恩化學試劑有限公司，免疫組化及Western blot NGAL 一抗購自美國Abnova 公司，免疫組化二抗試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?，Western blot 二抗及配膠、轉膜、顯影試劑購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 模型制作

重量大于200 g 的SD 大鼠，標準飼料喂養，其中5 只SD 雄性大鼠作為空白對照，55 只SD 雄性大鼠持續使用無菌無熱原灌胃針經胃給四氯化碳，首次劑量為20 μL，后續計量根據上次劑量灌胃后48 h 體重變化調整。 等腹水出現后，四氯化碳劑量減至20 μL，12～16 周后，肝硬化腹水模型建立[7]。

1.3 免疫組化法測定腎臟NGAL 表達

收集的大鼠腎臟標本首先經過10%的甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟、水化、抗原修復、NGAL 一抗4℃冰箱過夜、二抗37℃孵育10 min、DAB 顯色、PBS 終止染色、封片等。 按照文獻[8]所示方法進行分級，NGAL 的染色強度分為0～3 分，0 分為無染色，1 分為弱染色，2 分為中等程度染色，3 分為強染色。NGAL 染色百分比分為0～3 分，其中0 分為陽性細胞數所占百分比為0，1 分為<25%，2 分為25%～50%，3分為>50%。 綜合上述兩者得分，其中低度表達組得分為0，1，2 分，中度表達組得分為3，4 分，高度表達組得分為6 分，NGAL 極高度表達組得分為9 分。

1.4 Western blot 測定腎臟NGAL 表達

取肝硬化大鼠腎臟組織稱重，液氮、研缽磨碎組織塊，每克組織加3 mL 含PMSF 的RIPA 裂解液，4℃下玻璃勻漿器勻漿，冰上孵育30 min；4℃，15 000 r/min離心15 min，Bradford 比色法測定上清液蛋白質濃度，蛋白質煮沸變性，等量上樣，電泳，電轉膜儀轉膜，顯色，分析比較記錄。

1.5 腎功能測定

采集大鼠血液，分離出血清，采用Olympus AU21000型全自動生化分析儀測定尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）。

1.6 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0 對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型建立

本實驗中，對照組有5 只大鼠。 55 只大鼠用來建立模型， 在此過程中27 只大鼠死亡，28 只出現肝硬化腹水。

2.2 分組及NGAL 在肝硬化腎功能損傷時腎臟表達的部位情況

按照免疫組化腎臟表達NGAL 的強度和陽性細胞數建立不同級別組：NGAL 低度表達組，NGAL 中度表達組，NGAL 高度表達組，NGAL 極高度表達組，其中低度表達組有大鼠14 只，中度表達組有大鼠7 只，高度表達組有大鼠4 只，極高表達組有3 只。 在上述四組中，腎臟NGAL 表達主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位，腎小球未見明顯分布。 見圖1。

圖1 大鼠肝硬化模型腎臟NGAL 表達免疫組化結果

2.3 不同組別NGAL 的相對表達量

進一步進行Western blot 檢測了不同組之間的NGAL 相對表達量，和上述結果相似，極高表達組的NGAL 相對表達量（NGAL/β-actin）為1.0063±0.0159，高度表達組NGAL 相對表達量為0.8543±0.0054，中度表達組NGAL 相對表達量為0.7074±0.0191，低度表達組NGAL 相對表達量為0.4535±0.0143；腎臟NGAL 在極高度表達組明顯高于其他三組，而高度表達組明顯高于中低度表達組，中度表達組又高于低度表達組且上述差異均有統計學意義（P < 0.05）。 見圖2。

圖2 大鼠肝硬化模型腎臟NGAL 表達Western blot結果及蛋白條帶的半定量分析

2.4 腎臟NGAL 表達強度與大鼠血中BUN、Cr 的關系

從低度、中度表達組到高度、極高度表達組，隨著NGAL 表達強度的增強，血Cr，BUN 在各組間呈遞增變化，且各組間差異有統計學意義（P < 0.05）。 見表1。

表1 大鼠肝硬化模型不同NGAL 表達組腎功能BUN、Cr 表達變化（±s）

表1 大鼠肝硬化模型不同NGAL 表達組腎功能BUN、Cr 表達變化（±s）

注：A 為低度表達組，B 為中度表達組，C 為高度表達組，D 為極高度表達組；與A 組比較，*P < 0.05；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

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3 討論

腎功能障礙特別是肝腎綜合征，是晚期肝硬化患者最常見的臨床并發癥，主要由于全身或內臟動脈舒張、腎素-血管緊張素-醛固酮系統、交感神經系統和非滲透性的血管加壓素等神經介質系統的激活引起腎血管收縮、腎血流量減少、腎皮質灌注不足所引起的急性腎臟損傷[9]。 尿中的NGAL 能夠分層診斷肝硬化患者腎功能損害及確診肝硬化患者的急性腎臟損傷[10-11]。研究發現在肝硬化動物模型中，腎臟NGAL 的表達與腎功能受損密切相關，且NGAL 主要表達在功能受損的腎臟近曲腎小管及遠端腎單位。

肝硬化患者尿液中的NGAL 變化能敏感地提示肝硬化腎功能受損及損傷的程度[10-11]，和上述結果相似，在本肝硬化模型中腎臟NGAL 表達提示腎臟功能損害程度。 隨著NGAL 表達強度的增強，血BUN 及Cr 在各組間呈遞增變化。 這為肝硬化時腎臟NGAL表達與肝硬化時腎臟功能損害之間的關系提供直接證據。而對于急性腎臟損傷時NGAL 表達增加的機制目前還不是太清楚，可能為在急性腎損傷時，腎臟遠側腎單位為了修復損傷的腎小管上皮細胞而合成和釋放NGAL[12]，進一步需進行肝硬化患者腎臟穿刺活檢檢測NGAL 表達并進行明確的機制研究。

在腎臟缺血性損傷的動物模型中，近曲腎小管NGAL 表達與損傷修復有密切關系[3]。 在腎小管細胞培養過程中，NGAL 能夠促進上皮細胞形成[13]。肝硬化腎臟功能損傷時NGAL 主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位。 這可能與NGAL 參與腎小管損傷修復有關。 另外，NGAL 參與鐵的轉運，鐵離子可能會對腎小管細胞有毒性作用，在腎小管細胞受損傷時，NGAL 可能作為鐵離子的儲存庫以阻止鐵離子對腎小管上皮細胞的毒性損害作用。這些都需要進一步的機制研究以明確NGAL 在肝硬化腎功能損傷中的作用及機制。

總之，本研究發現肝硬化腎臟功能損傷時腎臟NGAL 主要分布于近曲腎小管及遠端腎單位，且其表達提示腎臟損傷程度。 這為肝硬化腎臟損傷與腎臟NGAL 的表達提供直接的證據。

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