低氘水抑制宮頸癌Hela細胞增殖和侵襲能力的研究

張 力張瀚彬陳 淼 鄔永富 黃浩海 祝葆華 楊慧齡

廣東醫學院中美腫瘤研究所，廣東東莞 523808

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤中第3 位最常見的 癌癥，也是導致女性癌癥患者死亡的第4 大原因，并占了近10%的新診斷癌癥病例和8%的癌癥死亡總數[1]。全球宮頸癌發病率在1980 年每年約378 000 例，到2010 年已增加到每年約454 000 例[2]。 據估計每年我國新發宮頸癌病例約100 000 例，占世界子宮頸癌新發病例總數的1/5[3]。目前宮頸癌的主要治療手段是手術、放射治療和化學藥物治療。

在自然界中，水是由氕（H）和氘（D）兩種氫的非放射性穩定同位素和氧組成的化合物。氘與氧組成的水稱為重水，天然水中，氘和氕的比率（D∶H）大約是1∶6600，即自然界水中氘的體積分數為0.0139%～0.0151%[4-8]。 因此，把氘體積分數低于0.015%的水稱為低氘水（DDW）。 由于氘對氕在質量上相差約1 倍以及C-D 鍵比C-H 鍵牢固不易斷裂，水中同位素氕和氘含量的變化會導致水的物理化學和核性質顯著差異。 有研究表明，氘能置換生物體內的氕并蓄積下來，隨著生物體內氘濃度的增加，氫鍵間交聯發生改變，從而使細胞質剛性顯著增加，有絲分裂受阻滯[9-12]。飲用DDW 可以預防疾病、延緩衰老、活化機體免疫細胞[13-14]。近年國外核醫學領域和水生理學領域對DDW在某些癌癥等疾病的輔助治療的應用研究有了重大突破[15-18]。 本文中將比較多種含有不同濃度氘的培養基對Hela 細胞株生長影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DDW（體積分數為0.005%，50×10-6）購自上海奧特泉公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；宮頸癌細胞株Hela 購自美國ATCC， 并由中美腫瘤所保種；DMEM、RPMI 1640 培養基購自Gibco 公司；PI 染料購自北京索萊寶公司；核糖核酸酶A（RNaseA）購自Invitrogen；MTT 試劑盒購自北京索萊寶公司；p21 Waf1/Cip1（12D1） Rabbit mAb 購自Cell Signaling；βactin （13E5） Rabbit mAb 購 自Cell Signaling；Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）購自Invitrogen；Na+/K+-ATPase ɑ （H-3） mouse monoclonal lgG2b購自Santa Cruz； 免疫組化試劑UltraVision Quanto Detection System HRP Quanto & DAB Quanto 購自Thermo Scientific；其他試劑均為進口分析純。

1.2 細胞培養及實驗分組

宮頸癌Hela 細胞培養于含有10% FBS 的1640培養基中，置于含5%（體積分數）CO2的37℃培養箱培養。 DDW（100×10-6、75×10-6、50×10-6，實驗組）與普通超純水（150×10-6，對照組）按體積比分別配置成用于Hela 培養的1640 培養基。

1.3 MTT 法檢測DDW 對細胞增殖活性的影響

用不含血清的1640 培養基饑餓培養Hela 細胞24 h 后，用含乙二胺四乙酸（EDTA）0.25%胰酶消化，計數， 以5×103個細胞/孔的密度接種于96 孔培養板中，每孔分別加入100 μL 含10%FBS 普通1640 培養基（150×10-6，對照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）1640 培養基（實驗組），各設3 個復孔，置于37℃、5%（體積分數）CO2培養箱中培養24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT 溶液繼續培養4 h，吸去培養液，每孔加100 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，選擇490 nm 波長，測定各孔的光密度（OD）值。結果取3 次實驗平均值。計算DDW 對細胞的增殖抑制率。 抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%。

1.4 細胞劃痕實驗

按實驗“1.3”項下方法收集細胞加入6 孔板中，密度為6×105個細胞/孔。用10%FBS 普通1640 培養基（150×10-6，對照組）及含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養基（實驗組）進行培養12 h。等細胞貼壁完全后，用移液槍的10 μL 無菌槍頭在各個孔內輕劃一條直線，在同一放大倍數下測量直線寬度并做好記錄，作為0 h 數據。48 h 后，從培養箱中取出細胞放置在顯微鏡下觀察所劃直線寬度變化，并拍照，在同一放大倍數下測量直線寬度并做好記錄作為24 h數據。將實驗組（100×10-6、75×10-6、50×10-6） 0 h 數據與24 h 數據差值，分別和對照組（150×10-6） 0 h 數據與24 h 數據差值對比。分析DDW 對細胞的侵襲能力影響差異是否有統計學意義。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

按實驗“1.3”項下方法收集Hela 細胞以1×105個細胞/mL 的密度接種于直徑為6 cm 的培養皿中，分別加入含10%FBS 的普通1640 培養基 （150×10-6，對照組） 或不同氘濃度 （100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養基（實驗組）培養24 h，用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集細胞。 用70%乙醇固定，4℃過夜，PBS 清洗1 次，1000 r/min 離心5 min，棄上清；PBS 再清洗1 次，1000 r/min 離心5 min，棄上清；每管加入500 μL 染色液（500 μL PBS+2.5 μL PI+2 μL RNaseA），37℃水浴避光染色30 min，經60 目尼龍網篩過濾，立即用流式細胞儀分析。 計數1×104個細胞，觀察細胞周期各期的分布特征。

1.6 Western blot 法檢測Hela 細胞p21 蛋白的表達水平

按實驗“1.3”項下方法收集Hela 細胞并計數，以1×105個細胞/mL 的密度接種于直徑6 cm 培養皿中，分別加入含10%FBS 的普通1640 培養基（150×10-6，對照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養基（實驗組）培養24 h，棄培養基，PBS 洗滌3 次，加入細胞裂解液RIPA 200 μL 裂解，并加入蛋白酶混合抑制劑20 μL，置冰上30 min 讓其充分裂解，細胞刮子收集細胞，4℃、10 000 r/min 離心15 min，吸取上清液分裝置-80℃備用。 NanoDrop 微量紫外分光光度計測定蛋白含量，各孔的蛋白上樣總量一致，均為100 μg。電泳濃縮膠80 V，50 min，分離膠110 V，150 min。經過10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，110 V 500 mA 轉膜120 min，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。采用室溫含2.5%脫脂奶粉的PBST（400 mL PBS+40 μL 吐溫20） 封閉60 min，按抗體要求的比例加入兔抗p21 一抗（1∶3000）、兔抗β-actin一抗（1∶3000），4℃過夜，室溫復性1 h，PBST 洗膜4 次，10 min/次，按一定比例（1∶10000）加入相應的Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）二抗，室溫避光孵育120 min。PBST 洗去未結合的二抗3 次，10 min/次，Western blot 紅外熒光顯像儀顯影。

1.7 免疫組織化學LP 法檢測p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達變化

按實驗“1.3”項下方法將Hela 細胞消化后，分別在6 孔板中每孔平行加入6×105個細胞。用普通含10%FBS 1640 普通培養基（150×10-6）及低氘濃度（50×10-6）的1640 培養基進行培養24 h 后，除去培養基，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，10%正常羊血清孵育，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS 緩沖液（Na2HPO48.1 mmol/L，KH2PO41.5 mmol/L，NaCl 137 mmol/L，2.7 mmol/L，pH 7.4） 振蕩清洗后分別滴加二、 三抗，DAB 顯色,蘇木精復染。 陽性信號呈棕色細顆粒狀。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氘水對Hela 細胞增殖的影響

含氘濃度為100×10-6、75×10-6、50×10-6的培養基培養24 h 對Hela 細胞的抑制率分別為16.01%、26.17%和33.39%，48 h 的抑制率分別為7.98%、25.27%和34.5%，72 h 的抑制率分別為11.42%、21.46%和39.54%。各實驗組與對照組比較差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。 見表1。

表1 低氘水對Hela 細胞增殖的影響（±s，n = 6）

表1 低氘水對Hela 細胞增殖的影響（±s，n = 6）

注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

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2.2 低氘水對Hela 細胞遷移侵襲能力的影響

含100×10-6、75×10-6、50×10-6DDW 的培養基（實驗組）培養48 h 對Hela 細胞的遷移侵襲能力有抑制作用，與對照組（150×10-6）相比，75×10-6、50×10-6DDW的抑制作用較為明顯（P < 0.01）。 見圖1。

圖1 低氘水對細胞遷移侵襲能力的影響

2.3 低氘水對Hela 細胞周期的影響

從圖2 可以看出，DDW 對宮頸癌Hela 細胞周期具有抑制作用，隨著培養基中氘濃度的降低，Hela 細胞主要表現為G1、G2期靜止或略微增加，S 期逐漸降低；其中，氘濃度為75、50 ppm 的抑制作用較為明顯，S 期明顯減少（P < 0.01），見表2。

表2 各組Hela 細胞周期情況（%，±s，n = 3）

表2 各組Hela 細胞周期情況（%，±s，n = 3）

注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

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2.4 低氘水對p21 蛋白的表達的影響

分別用含氘濃度100×10-6、75×10-6、50×10-61640 培養基（實驗組）和氘濃度150×10-6的正常1640 培養基（對照組）處理Hela 細胞24 h 后，Western blot 法檢測發現DDW 能夠明顯上調宮頸癌Hela 細胞中p21 蛋白的表達（圖3）。Hela 細胞中p21 蛋白在氘濃度為100、75、50 ppm 的培養基（實驗組）中表達灰度值分別為（0.717±0.037）、（0.979±0.082）、（1.146±0.087），與對照組（0.539±0.042）比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

圖2 低氘水對Hela 細胞周期的影響

圖3 Western blot 法檢測p21 蛋白的表達

2.5 低氘水對p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達的影響

分別用氘濃度為150×10-6普通1640 培養基和氘濃度為50×10-6的1640 培養基處理Hela 細胞24 h后，免疫組化檢測p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達變化。從圖4 中可以看出，經過染色后可以發現p21 蛋白在氘濃度為50×10-6的1640 培養基中的表達明顯高于氘濃度為150×10-6正常1640 培養基；而Na+/K+-ATPase在氘濃度為50×10-6的1640 培養基中的表達明顯低于氘濃度為150×10-6正常1640 培養基。

圖4 免疫組化LP 法檢測p21、Na+/K+-ATPase 蛋白的表達

3 討論

在前期研究中發現，DDW 可以抑制肺癌、鼻咽癌和肝癌腫瘤細胞的生長以及在延長癌癥患者生存期方面具有積極的作用[19-23]。 然而目前尚未見低氘水對宮頸癌的作用研究的相關報道。本研究將Hela 細胞用不同DDW 濃度的培養基處理，用MTT 法、劃痕實驗觀察到隨著培養基中氘濃度下降，Hela 細胞的增殖和侵襲轉移能力得到明顯的抑制，在氘濃度為50×10-6的培養基，72 h 的增殖抑制率達到39.54%（P<0.01）。 劃痕實驗發現，DDW 對宮頸癌細胞的侵襲能力具有抑制作用，同樣在50×10-6時差異性最明顯（P < 0.01）。Western blot 和免疫組化檢測相關蛋白的表達情況，發現DDW 能選擇性上調Hela 細胞中p21 蛋白的表達水平， 下調Na+/K+-ATPase 的表達。 p21waf基因是p53 基因重要的下游基因之一, 其表達產物p21 蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白。 p21 可以和p53 共同構成細胞周期G1檢查站。因DNA 損傷后不經過修復則無法通過G1檢查站，減少了受損DNA 的復制和積累，從而發揮抑癌作用。 Sultana 等[24]研究發現，宮頸癌患者對化療的敏感性是通過p53-Bax 調節通路，誘導細胞凋亡而起作用；先期化療可以促進宮頸癌患者CD8+和CD4+陽性的T細胞、自然殺傷細胞誘導產生干擾素γ，通過免疫系統而起作用。 Gy?ngyi 等[25]證實，DDW 能降低經致癌源處理大鼠C-myc、Ha-ras 和p53 基因表達。 本研究用流式細胞術檢測含不同氘濃度的培養基對Hela 細胞周期的影響。 隨著DDW 氘濃度的降低，主要表現為G1、G2期逐漸 增加，S 期逐漸減少。 這 很可 能 是DDW 選擇性抑制Hela 宮頸癌細胞株增殖和轉移能力的分子機制之一，即通過p53 介導，有效上調p21影響細胞的周期進程和凋亡，從而達到對腫瘤細胞的抑制作用。 Na+/K+-ATPase 是腫瘤組織異常增生的物質基礎之一，與正常細胞相比，腫瘤細胞內的Na+/K+-ATPase 活性是顯著升高的。李春曉等[26]及Usta 等[27]研究表明，抑制Na+/K+-ATPase 活力可作為一種新的治療乳腺癌和肝癌的有效手段。 本研究Western blot 和免疫組化結果顯示，經DDW 處理的Hela 細胞，Na+/K+-ATPase 蛋白明顯下調。 這些結果說明，降低細胞生長環境中的氘體積濃度，可以抑制Hela 宮頸癌細胞株的增殖和轉移能力，DDW 具有選擇性抗腫瘤的靶向生物效應。

人類乳頭狀瘤病毒（HPV）和吸煙是宮頸癌的兩大危險因素，HPV 感染是最主要的因素，幾乎所有的宮頸癌都與HPV 感染有關[28]。 宮頸癌的主要治療手段是手術、放射治療和化學藥物治療。 手術治療主要適用于早期宮頸癌（ⅠA～ⅡA 期）患者。雖然傳統上認為，宮頸癌對化療藥物不敏感，治療方法以手術和放療為主，但是大量的腫瘤細胞學研究進展和臨床實踐證實，對于亞臨床和微小的轉移灶手術和放療并不能完全控制和消除。 因此，作為治療癌癥有效方法之一的化療在宮頸癌的綜合治療中的地位也越來越受到重視。近年來，研究表明，癌細胞增長機制與氘原子有很大的關系，通過降低體內氘的濃度，可以抑制體內癌細胞的增長。因此，DDW 作為新型無毒副作用抗癌輔助治療劑在腫瘤治療中將具有重要應用前景。

[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA： A Cancer Journal for Clinicians，2011，61（2）：69-90.

[2] Forouzanfar MH，Foreman KJ，Delossantos AM，et al.Breast and cervical cancer in 187 countries between 1980 and 2010：a systematic analysis [J]. Lancet，2011，378（9801）：1461-1484.

[3] Zheng BW，Chen CD，Wei AX，et al. Guangdong in 370000 cases of women with uterine cervical cytology test in the screening of cervical lesion studies [J]. The Practical Journal of Cancer，2008，23（3）：248-249.

[4] Horita J，Rozanski K，Cohen S. Isotope effects in the evaporation of water： a status report of the Craig-Gordon model [J]. Isotopes in Environmental and Health Studies，2008，44（1）：23-49.

[5] Gross PR，Spindel W. Mitotic arrest by deuterium oxide [J].Science，1960，131（3392）：37-38.

[6] Brooks SC. Osmotic effects of deuterium oxide（heavy water）on living cells [J]. Science，1937，86（2239）：497-498.

[7] Gross PR，Clifford V. Blockade of deoxyribonucleic acid synthesis by deuterium oxide[J].Science，1961，133（3459）：1131-1133.

[8] Pijima M，Yoshida T，Kato T，et al. Visualization of lateral water transport pathways in soybean by a time of flightsecondary ion mass spectrometry cryo-system [J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（6）：2179-2188.

[9] Lamprecht J，Schroeter D，Paweletz N. Derangement of microtubule arrays in interphase and mitotic PtK2 cells treated with deuterium oxide（heavy water） [J]. Journal of Cell Science，1991，98（Pt4）：463-473.

[10] Rowning BA，Wells J，Wu M，et al. Microtubule-mediated transport of organelles and localization of beta -catenin to the future dorsal side of Xenopus eggs [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（4）：1224-1249.

[11] 何相華，呂加平.恐龍滅絕之謎新解[J].發明與創新：綜合版，2006，5 （10）： 33-34.

[12] Murphy J，Desaive C，Giaretti W，et al. Experimental results on mammalian cells growing in vitro in deuterated medium for neutron-scattering studies [J]. Journal of Cell Science，1977，25（25）：87-94.

[13] Czajka DM，Finkel AJ，Fischer CS，et al. Physiological effects of deuterium on dogs [J]. The American Journal of Physiology，1961，201（201）：357-362.

[14] Friedman I，Smitgi. Deuterium content of snow cores from sierra nevada area [J]. Science，1970，169（3944）：467-470.

[15] White KO，Watkins WR，Bruce CW，et al. Water vapor continuum absorption in the 3.5-4.0-microm region [J].Applied Optics，1978，17（17）：2711-2720.

[16] Haulicǎ I，Peculea M，Stefǎnescu I，et al. Effects of heavy and deuterium-depleted water on vascular reactivity [J].Romanian Journal of Physiology ：Physiological Sciences，1998，35（1-2）： 25-32.

[17] Bild W，Stefanescu I，Haulica I，et al. Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water [J]. Romanian Journal of Physiology：Physiological Sciences，1999，36（3-4）：205-218.

[18] Bild W，Nǎstasǎ V，Haulicǎ I. In vivo and in vitro research on the biological effects of deuterium-depleted water： 1. Influence of deuterium-depleted water on cultured cell growth [J]. Romanian Journal of Physiology：Physiological Sciences，2004，41（1-2）： 53-67.

[19] Usta J，Kreydiyyeh S，Knio K，et al. Linalool decreases HepG2 viability by inhibiting mitochon drial complexesⅠand Ⅱ，increasing reactive oxygen species and decreasing ATP and GSH levels [J]. Chemico-biological Interactions，2009，180（1）： 39-46.

[20] Somlyai G，Jancsó G，Jákli G，et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells[J].FEBS Letters，1993，317（1-2）：1-4.

[21] Wang HQ，Zhu BH，He ZW，et al. Deuterium-depleted water （DDW）inhibits the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro [J]. Biomedicine& Pharmacotherapy，2013，67（6）：489-496.

[22] 王宏強,祝葆華,劉聰,等.低氘水可選擇性抑制鼻咽癌細胞增殖[J].南方醫科大學學報，2012，32（10）：1394-1399.

[23] 王坤,祝葆華,王宏強,等.低氘水對肝癌HepG2 細胞增殖和侵襲能力的抑制作用[J].廣東醫學院學報，2013，31（3）：241-244.

[24] Sultana H，Kigawa J，Kanamori Y，et al. Chemosensitivity and p53-Bax pathway-mediated apoptosis in patients with uterine cervical cancer [J]. Annals of oncology：official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO，2003，14（2）：214-219.

[25] Gy?ngyi Z，Somlyai G. Deuterium depletion can decrease the expression of C-myc Ha-ras and p53 gene in carcinogen -treated mice [J]. In vivo （Athens，Greece），2000，14（3）：437-439.

[26] 李春曉,李偉,王薇，等.P21 蛋白在不同級別宮頸組織中的表達及其與高危HPV 感染相關性的研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2009，18（1）：44-48.

[27] Usta J，Hachem Y，El-Rifai O，et al. Fragrance chemicals lyral and lilial decrease viability of HaCat cells' by increasing free radical production and lowering intracellular ATP level： protection by antioxidants [J]. Toxicology in vitro ： An International Journal Published in Association with BIBRA，2013，27（1）：339-348.

[28] Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al. Human papillomavirus and cervical cancer[J].Lancet，2007，370（9590）：890-907.