蘋果黃酮的分離純化及抗油脂氧化研究

姚紅娟，唐浩國*，郭介之，張艷梅

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

蘋果黃酮的分離純化及抗油脂氧化研究

姚紅娟，唐浩國*，郭介之，張艷梅

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

采用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱對大孔樹脂分離后的黃酮進行純化，不同體積分數的甲醇溶液進行洗脫，洗脫流速為0.8 mL/min，得到兩種化合物單體A和B。高效液相色譜法檢測（流動相甲醇和水，DAD檢測器，檢測波長280、358 nm），化合物A為綠原酸，B是黃酮類物質，通過顏色反應和紫外光譜進行初步結構鑒定，B為黃酮醇類物質，在7位和4’ 位有鄰二酚結構。以過氧化值為指標，采用烘箱法對比化合物B、蘆丁、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）的抗油脂氧化的能力，3 種物質對芝麻油的自動氧化影響不大，BHT與化合物B可以阻止豬油氧化酸敗，抗氧化效果BHT＞化合物B＞蘆丁。

蘋果；黃酮；分離；純化；油脂抗氧化

2010年中國蘋果年產量3326.52萬t，占世界總產量47.8%（聯合國糧食及農業組織數據），且以每兩年300萬t的速度持續增加[1]，己基本滿足我國國民對蘋果鮮果的消費需求[2]，蘋果市場依然停留在鮮果及初加工階段，為提高蘋果產業價值，必須在深加工領域尋求突破。

蘋果中含有豐富的類黃酮物質[3]對蘋果總抗氧化能力（total anti-oxidant capacity，TAC）的貢獻率可達45%～48%[4]。研究表明類黃酮可作為超氧陰離子自由基和羥自由基的清除劑在起始階段抑制脂質過氧化[5]，有很強的抗活性氧自由基功能，同時對動物的脂質代謝有調節作用，可降血脂，降血壓，保護心腦血管，抗癌抗突變[6]，具有很強的保健功能。

本實驗將提取蘋果中的黃酮進行抗油脂氧化方面的研究，與傳統的有安全隱患的油脂抗氧化劑BHT[7-8]及黃酮代表物質蘆丁抗油脂氧化能力做比較，為找到新型抗油脂氧化劑及提高蘋果附加價值提供可實際運用的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售新鮮靈寶紅富士，洗凈，均勻切成5mm薄片，去核，在沸水中加熱10 s，以破壞多酚氧化酶，防止褐變；將蘋果片表面的水分用濾紙吸干，放入打漿機中打漿，用75%乙醇溶液在80 ℃條件下浸提兩次[9]，旋轉蒸發濃縮，醇沉，取上清液，干燥得醇提物，過AB-8大孔樹脂[10]，得黃酮粗產物，干燥后在冰箱中冷藏備用；市售肥豬肉煉制的豬板油，市售石磨香油。

蘆丁標準品 上海晶純生化科技股份有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）標準品 美國Sigma公司；二氫查爾酮標準品 上海晶純生化科技股份有限公司；Sephadex LH-20 鄭州勤實科技有限公司；高效液相色譜所用甲醇為色譜級 成都市科龍化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀（Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）） 美國安捷倫公司；722S紫外分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；UV-2800型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；玻璃中壓分離凝膠層析柱（16 mm×300 mm）、蘭格蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司；BS-100自動部分收集器 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果黃酮的純化

1.3.1.1 蘆丁標準曲線的繪制

采用鋁鹽絡合顯色法，通過文獻[11]方法操作，得蘆丁標準曲線的回歸方程：y=1.196x+0.005 98，式中：x為蘆丁質量濃度/（mg/mL），y為吸光度A510nm，線性范圍為0～0.5 mg/mL，相關系數R2=0.999。

1.3.1.2 利用Sephadex LH-20純化分離蘋果黃酮

過葡聚凝膠柱的甲醇、水均要求通過0.45 μm的微孔濾膜過濾，上樣液過0.22 μm有機濾膜。

1）Sephadex LH-20的預處理

取23g干燥的Sephadex LH-20，用150 mL甲醇充分溶脹，濕法裝柱（中壓分離凝膠層析柱16 mm×300 mm），為防止溶解熱效應，使葡聚糖凝膠柱產生氣泡，采用甲醇體積分數逐漸降低的方式進行柱平衡，最終達到20%甲醇平衡。

2）黃酮的分離純化

取151.2 mg粗黃酮，硝酸鋁法檢測黃酮純度[12]為93.29%，用20 mL甲醇溶解，過0.22 μm有機濾膜，取1 mL濾液注射到層析柱中，以0.8 mL/min的流速進行梯度洗脫，用體積分數為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的甲醇溶液分別洗脫60 min，然后用純甲醇洗脫至高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測為直線時停止，自動部分收集器以每管10min的頻率收集。

3）繪制Sephadex LH-20動態洗脫曲線

每管均用NaNO2→Al(NO2)3→NaOH法檢測總黃酮含量，獲得Sephadex LH-20的動態洗脫曲線，根據其數據變化，選擇進高效液相的樣品。

4）色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：A為甲醇，B為去離子水，梯度洗脫，起始流動相為純水，線性遞增10 min，使甲醇體積分數從0增至100% A，后運行5 min，使甲醇體積分數由100%線性遞減至0。流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測器DAD，檢測波長358 nm和280 nm。

5）用高效液相色譜檢測洗脫產物

根據洗脫曲線選擇吸光度變化處的洗脫液進行HPLC檢測，觀察各個洗脫液的HPLC圖譜，若圖譜中有若干個較大的峰，說明此階段的洗脫液為混合物，各物質沒有得到很好的分離；若HPLC圖譜中只有一個峰，說明所檢測的洗脫液中只有一種物質，得到了單體化合物，可進行接下來的結構鑒定。本實驗僅選用單體化合物的HPLC圖譜，化合物分離不成功的洗脫液HPLC圖譜不再展示。

1.3.2 蘋果黃酮的結構鑒定

1.3.2.1 顏色鑒定

取適量的樣品溶液，分別與濃硫酸、醋酸鎂、三氯化鋁、三氯化鐵、鹽酸-鋅粉、氫氧化鈉和硼氫化鈉溶液反應，觀察顏色變化，并照射紫外燈，觀察熒光反應。

1.3.2.2 紫外光譜掃描

取適量樣液，加入位移劑：甲醇鈉、乙酸鈉、乙酸鈉和硼酸、三氯化鋁和三氯化鋁與鹽酸，在200～450nm區間進行掃描。

1.3.3 蘋果黃酮的抗油脂氧化性實驗

抗油脂氧化實驗設計兩組，一組為動物油新煉制豬油，一組為植物油芝麻油。準確稱取50.0g油脂數份，置于100mL的燒杯中，分別以油質量0.02%的量添加黃酮樣品、蘆丁、BHT，并設置空白對照。放置在（60±1）℃烘箱中，每12h振蕩1次，并交換在烘箱中的位置。定期測定過氧化值（peroxide value，POV），測定方法采用GB/T 5538—2005/ISO 3960：2001《動植物油脂過氧化值測定》。

2 結果與分析

2.1 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱純化

由圖1可知，主要出峰點集中30%甲醇部分（6～13管）和洗脫體積分數從60%變化至100%的部分（27～54管），根據其吸光度A510nm的變化，選擇第5、8、13、15、17、20、23、29、33、36、39、42、45、49、53、57、61、65、70、72管進高效液相，檢測分離情況。

圖1 Sephadex LH-20的動態洗脫曲線Fig.1 Dynamic elution curves on Sephadex LH-20

2.2 HPLC檢測結果

圖2 標準樣品的HPLC色譜Fig.2 HPLC chromatogram of standard samples at 280 and 358 nm

圖2 是蘆丁標品和二氫查爾酮標品的色譜圖，通過掃描得到蘆丁的最大吸收峰在256 nm和358 nm，二氫查爾酮的最大吸收峰在280 nm，因此選擇280 nm和358 nm為HPLC的檢測波長。二氫查爾酮的保留時間為8.982 min，上樣液的高效液相色譜圖顯示粗黃酮中僅含有微量的二氫查爾酮；蘆丁標品的保留時間是8.335 min，上樣液HPLC色譜圖（圖3）顯示在保留時間8.333 min處有蘆丁的吸收峰，說明蘋果粗黃酮中含有一定量的蘆丁。

圖3 上樣液在檢測波長280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoid extract at 280 (a) and 358 nm (b)

圖4 洗脫產物A在檢測波長280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoid extract A at 280 (a) and 358 nm (b)

根據Sephadex LH-20的動態洗脫曲線的篩選結果進行HPLC檢測，成功分離兩種單品，化合物A（保留時間5.033min，圖4）與化合物B（保留時間7.890min，圖5）。結合圖1可知，化合物A主要集中在8～13管，化合物B集中在33～36管。本實驗采用的是甲醇-水體系，進行反相洗脫，利用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠的反相分配作用[13]，根據極性大小對混合物進行分離，極性越小洗脫下來的時間越長，化合物A在Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱中保留性弱最先被洗脫出來，以此可推測化合物A的極性更大。

圖5 洗脫產物B在檢測波長280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.5 HPLC chromatogram of extract B at 280 nm (a) and 358nm(b)

圖6 化合物A的紫外光譜Fig.6 UV spectrum of compound A

分析圖6化合物A的紫外光譜圖可知化合物A有兩個較強吸收峰，其中一個出現在210～220 nm，一個出現在330 nm，在250 nm和300 nm有兩個肩峰，與黃酮的特征吸收峰不符，但與綠原酸[14]紫外光譜圖完全相同，可基本判斷化合物A為綠原酸，屬于酚類物質，不屬于黃酮類物質，接下來將不在對化合物A做具體的結構分析與抗氧化實驗。

圖7為化合物B的紫外光譜圖，化合物B的紫外圖譜在250 nm和360 nm處有強吸收峰，是黃酮類化合物圖譜的特點[15]，可以基本判定化合物B為黃酮類化合物。重復1.3.2.1節操作，收集33～36 管洗脫液，進行HPLC檢測，減壓濃縮，冷凍干燥，得23.6 mg黃酮類化合物B，利用高效液相面積歸一法測其純度為88.448%。

圖7 化合物B的紫外光譜Fig.7 UV spectrum of compound B

Sephadex LH-20的動態洗脫曲線顯示在5～15管，用硝酸鋁法檢測黃酮含量很高，HPLC檢測結果卻表明5～15管中含有的主要物質不是黃酮而是多酚類物質綠原酸。硝酸鋁法檢測黃酮的原理：在堿性條件下，Al3+與黃酮母核中無取代的鄰二酚羥基發生絡合反應。但綠原酸為多酚酸含有鄰二酚羥基，亦可與Al3+形成穩定的結構；本實驗硝酸鋁法測黃酮選用的標準品為蘆丁，其相對分子質量為610.52，綠原酸的相對分子質量354.31，即同樣質量的兩種物質，綠原酸提供鄰二酚羥基的量幾乎是蘆丁的1.72倍，綠原酸對測定結果產生大于50%的正性干擾[16]。粗黃酮的檢測純度高達93.29%也是由于綠原酸的干擾。在應用硝酸鋁法測黃酮時必須排除鄰二酚羥基化合物對結果的影響。

2.3 化合物B結構鑒定

2.3.1 顏色鑒定

表1 顏色反應實驗結果Table1 Results of color reaction

由表1可以初步判定化合物B為黃酮醇類化合物[17]。

2.3.2 紫外光譜鑒定

分析表2化合物B加入位移劑的紫外掃描結果，可知化合物B在甲醇中的紫外光譜吸收峰為351 nm和273 nm，屬于黃酮醇的典型吸收峰；甲醇鈉屬于強堿，可以使黃酮類化合物母核上所有的羥基均離子化，帶Ⅰ紅移51 nm，吸收帶隨時間延長沒有發生變化，應有4’-OH或7-OH；乙酸鈉為弱堿性，只有較強的酚羥基會被離子化[18]，帶Ⅱ紅移5 nm，應含有7-OH；乙酸鈉-硼酸使帶Ⅰ紅移10 nm，可推測B環上有鄰二酚羥基，帶Ⅱ紅移5 nm，應有6,7-2OH或7,8-2OH；氯化鋁可與黃酮母核上的羥基形成不穩定的絡合物，使帶Ⅰ紅移49 nm，加鹽酸后解離，紅移消失，則說明A、B環上同時有鄰二酚羥基[19]。綜合以上分析，化合物B為黃酮醇，確定在黃酮母核的3位置上有羥基取代，圍繞4’和7位置有鄰二酚羥基。

表2 化合物B的紫外掃描結果Table2 UV-Visible spectral data of compound B

2.4 化合物B油脂抗氧化性

在豬油和芝麻油中按油質量的0.02%添加各種各種抗氧化劑（蘆丁、BHT、化合物B），混合均勻后按GB/T 5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》測定油脂的過氧化值，空白組、蘆丁組和BHT組設有3組平行實驗，化合物B由于提取的含量極少，只有一組數據，未設平行組，結果見圖8。

圖8 不同抗氧化劑對油脂抗氧化活性的比較Fig.8 Comparison of inhibitory activity of different antioxidants on lipid oxidation

由圖8可知，對于豬油組，各抗氧化劑表現出不同的抗氧化活性，BHT干擾游離基反應，可以有效清除自由基[20]，對豬油的氧化酸敗有強烈的抑制作用，25d時過氧化值基本保持不變；黃酮類化合物是作為金屬離子絡合物來抑制油脂的自動氧化，蘆丁不能與金屬離子絡合，因此并不能抑制豬油的氧化酸敗，在油脂氧化酸敗的誘導期，與空白組差別不大，到傳播期，過氧化值迅速增加，超過空白組；從蘋果中提取的黃酮單體化合物B對豬油的氧化酸敗有明顯的抑制作用但效果不如BHT，化合物B與油脂中的金屬離子結合，降低了油脂中過氧化物的產生速率。對于芝麻油組，抗氧化劑與空白對照組的POV值差別很小，體現出的抗氧化作用BHT＞化合物B＞蘆丁。在相同的條件下芝麻油的氧化酸敗速率明顯低于豬油油脂，在芝麻油中添加油脂抗氧化劑沒有實際意義，這應與芝麻油中含有較多天然抗氧化劑VE、芝麻酚、芝麻素[21]有關。

從蘋果中提取的黃酮單體化合物B與蘆丁的抗油脂氧化性有顯著的差異，從結構上分析，兩者在B環上均有一個鄰二酚結構，但蘆丁的A環為間二酚結構，化合物B為鄰二酚結構。在羥基數相同的情況下，鄰二酚結構的抗氧化能力強于間二酚結構[22]，且A環鄰二酚羥基結構可以降低C環對A環的鈍化作用，使得化合物B僅就A環的抗氧化能力高于蘆丁；同時C環蘆丁的3-OH被蕓香糖取代，黃酮類化合物在阻止油脂自動氧化時，3-OH起決定性作用[23]，可聯合4位羧基與金屬離子形成穩定的螯合物，蘆丁沒有3-OH結構，表現出較差的抗油脂氧化能力。化合物B作為黃酮醇類物質，3-OH與油脂中的金屬離子形成穩定的絡合物，使金屬離子失去對油脂氧化的催化作用，但不能消耗自由基，可以延長油脂自動氧化的誘導期，并不能有效抑制油脂氧化。

3 結 論

粗黃酮提取物中含有一定量的綠原酸，用硝酸鋁法測其黃酮純度并不準確，利用Sephadex LH-20可以成功的把綠原酸與蘋果黃酮分離，并得到一個黃酮單體。利用不同濃度的甲醇溶液進行梯度洗脫的方法，不能將提取物中所有的黃酮單體都進行分離，如果要得到更多種類的黃酮單體，必須調整洗脫條件，利用不同的洗脫劑，做進一步的探索。

通過6個黃酮顏色鑒定反應，初步確定得到的黃酮單體為黃酮醇，利用5種位移劑對黃酮單體紫外光譜圖的影響，推測化合物B為黃酮醇，確定在黃酮母核的3位置上有羥基取代，圍繞4’和7位置有鄰二酚羥基。

從蘋果黃酮中分離得到的單體化合物B抗油脂氧化能力遠不如BHT，提取成本高，但安全性高，對人體也有一定的保健功能，在沒有改善提純工藝時并不適宜作普通油脂的抗氧化劑，可考慮在某些特殊保健品中添加；粗提物中含有較多綠原酸，綠原酸的抗油脂氧化能力強于BHT，可考慮利用蘋果黃酮的粗提物，進行油脂天然抗氧化劑的研究。

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Purification and Antioxidant Activities of Flavonoids from Apple

YAO Hong-juan, TANG Hao-guo*, GUO Jie-zhi, ZHANG Yan-mei
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Two monomer compounds, namely A and B, respectively, were purified on Sephadex LH-20 column by gradient elution with aqueous methanol at a flow rate of 0.8 mL/min from crude flavonoids extracted from apple and chromatographed on a macroporous resin column. High performance liquid chromatograph (HPLC) was employed to identify the monomers with a mobile phase consisting of methanol-water using diode array detector. The detection wavelengths were 280 and 358 nm. The results showed that compound A was chlorogenic acid and compound B was another flavonoid. The structure of compound B was identified by color reaction and UV spectroscopy as a flavonol with 7-bit and 4’o-diphenol structure. Based on peroxide value (POV), the antioxidant capacity of compound B, rutin and BHT were measured by oven-storage method. The effects of these three substances on sesame oil auto-oxidation were not obvious. The oxidative rancidity of lard could be prevented in the presence of either butylated hydroxy toluene or compound B. The decreasing order of the antioxidant capacit y of these three substances was BHT ＞ compound B ＞ rutin.

apple; flavonoids; isolation; purification; inhibition of lipid oxidation

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0083-06

10.7506/spkx1002-6 630-201411017

2013-10-30

姚紅娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：347513986@qq.com

*通信作者：唐浩國（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養學、食品生物技術和天然產物開發等。E-mail：tanghaoguo@126.com