苦蕎酒液態發酵工藝條件的優化

陳佳昕，趙曉娟，吳 均，杜木英*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715）

苦蕎酒液態發酵工藝條件的優化

陳佳昕，趙曉娟，吳 均，杜木英*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715）

以重慶酉陽生產的苦蕎為原料，應用液態發酵技術，通過單因素和正交試驗對苦蕎酒的釀造工藝條件進行優化，從而確定苦蕎酒的最佳工藝參數。結果表明：苦蕎酒最佳液化工藝條件為α-淀粉酶添加量0.15%、pH 6.5、溫度60 ℃、液化時間2.5 h；最佳糖化工藝條件為糖化酶添加量1.5%、pH 5.0、溫度60 ℃、糖化時間3 h；最佳發酵工藝條件為酵母菌添加量0.1%、發酵溫度28 ℃、pH 4.5。在此條件下發酵72h即可得到酒度為9°左右的苦蕎酒。

苦蕎酒；液態法；液化；糖化；發酵

蕎麥為蓼科蕎麥屬一年生草本植物，包括甜蕎和苦蕎兩個品種[1]。苦蕎麥又名韃靼蕎麥、野蕎麥、萬年蕎[2]，主要分布于我國云貴高原、西南山區及山西、陜西等地[3]。苦蕎含有豐富的蛋白質、脂肪、淀粉、礦物質和維生素[4]，還含有其他禾谷類作物沒有的葉綠素和生物類黃酮[5]。大量研究表明，苦蕎提取物中生物類黃酮、苦蕎蛋白、苦蕎糖醇等具有很強的生物活性，能降低血糖、血脂、尿糖，具有抗疲勞、抗衰老、抗炎鎮痛、抑制腫瘤細胞等作用[6-18]。

傳統釀酒工藝主要是固態及半固態發酵工藝，此工藝生產周期長，人工勞動強度大，原料利用率低，不適應現代化生產的要求。雖然苦蕎有很高的營養保健價值，但苦蕎酒的生產技術尚未成熟，市面上可見產品不多，液態發酵法生產苦蕎酒的研究報告更是少之又少，且原料大多為苦蕎及其他作物組成的復合物，因此研制一種以100%苦蕎為原料的既營養又美味且便于實現機械化和自動化生產的苦蕎酒符合當今酒類生產消費的發展趨勢。本研究以重慶酉陽生產的苦蕎為原料，通過單因素和正交試驗對苦蕎酒的釀造工藝條件進行優化，旨在為以后工業化生產提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎，產地重慶酉陽，選用顆粒飽滿無霉變的苦蕎通過高速粉碎機粉碎后過40目篩，置陰涼干燥地備用。

α-淀粉酶（酶活力≥3700U/g）、糖化酶（酶活力≥105U/g） 北京奧博星生物技術有限責任公司；釀酒高活性干酵母 安琪酵母有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；DFT-200型高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；PB-10型酸度計、FA2004型分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HH·B11·420-S-Ⅱ型恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；PSX-280A型手提高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；RHB-32ATC型手持糖度計 廈門晉力自動化有限公司；722-P可見分光光度計 上海現科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎酒制作的基本工藝流程

1.3.2 酵母的活化

將酵母用2%的糖水或4～5°Brix的稀糖化醪在35～40 ℃的溫水中復水15～20 min，然后將溫度降至34 ℃以下活化1～2 h即可。

1.3.3 指標測定

還原糖含量采用GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法；可溶性固形物采用手持糖度計直接測定；酒精度采用GB/T 13662—2008《黃酒》中的比重計法，以乙醇的體積分數計；黃酮含量采用GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法》。pH值采用pH計直接測定；總酸含量采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法；氨基酸態氮：采用GB/T 13662—2008《黃酒》中的酸度計法；溶液相對密度使用密度計法；葡萄糖當量（dextrose equivalent，DE）值表示溶液中淀粉的水解程度或糖化程度，是糖液中還原糖（以葡萄糖計）的含量占干物質的百分比[19]。

1.3.4 苦蕎酒液化條件的單因素試驗設計

1.3.4.1 α-淀粉酶液化溫度的確定

將苦蕎粉末按1∶4（m/V）的料液比糊化后，用2mol/L NaOH調節pH值至6.5，然后添加0.1%的α-淀粉酶，將其放置溫度分別為50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中水浴3 h，通過測定其DE值來確定最適液化溫度。

1.3.4.2 α-淀粉酶液化pH值的確定

將苦蕎粉末按1∶4（m/V）的料液比糊化后，用2 mol/L NaOH或2 mol/L檸檬酸調節pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，然后添加0.1%的α-淀粉酶，將其在60 ℃的水浴鍋中水浴3h，通過測定其DE值來確定最適液化pH值。

1.3.4.3 α-淀粉酶液化時間的確定

將苦蕎粉末按1∶4（m/V）的料液比糊化后，用2mol/L NaOH調節pH值至6.5，然后添加0.1%的α-淀粉酶，將其在60℃的水浴鍋中分別水浴1、1.5、2、2.5、3、3.5h，通過測定其DE值來確定最適液化時間。

1.3.4.4 α-淀粉酶液化添加量的確定

將苦蕎粉末按1∶4（m/V）的料液比糊化后，用2mol/L NaOH調節pH值至6.5，然后分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的α-淀粉酶，將其在60℃的水浴鍋中水浴3h，通過測定其DE值來確定最適液化酶添加量。

1.3.4.5 苦蕎酒液化條件的正交試驗設計

根據以上苦蕎酒液化條件的單因素試驗，確定各因素適合的水平范圍，設計四因素三水平的正交試驗，以液化DE值為考核指標，確定液化最優試驗組合。

1.3.5 苦蕎酒糖化條件的單因素試驗設計

1.3.5.1 糖化酶糖化溫度的確定

以1.3.4節得到的最佳液化條件的苦蕎液化液為研究對象，用2mol/L檸檬酸調節pH值至5.0，然后添加1%的糖化酶，將其分別放置溫度為50、55、60、65、70、75℃的水浴鍋中水浴3h，通過測定其還原糖含量來確定最適糖化溫度。

1.3.5.2 糖化酶最適pH值的確定

以1.3.4節得到的最佳液化條件的苦蕎液化液為研究對象，用2mol/L檸檬酸調節pH值分別至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，然后添加1%的糖化酶，將其放置55℃的水浴鍋中水浴3h，通過測定其還原糖含量來確定最適糖化pH值。

1.3.5.3 糖化酶糖化時間的確定

以1.3.4節得到的最佳液化條件的苦蕎液化液為研究對象，用2mol/L檸檬酸調節pH值至5.0，然后添加1%的糖化酶，將其在55℃的水浴鍋中分別水浴0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h，通過測定其還原糖含量來確定最適糖化時間。

1.3.5.4 糖化酶添加量的確定

以1.3.4節得到的最佳液化條件的苦蕎液化液為研究對象，用2mol/L檸檬酸調節pH值至5.0，然后添加1%的糖化酶，然后分別添加0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的糖化酶，將其在55℃的水浴鍋中水浴3h，通過測定其還原糖含量來確定最適糖化酶添加量。

1.3.5.5 苦蕎酒糖化條件的正交試驗設計

以1.3.4節得到的最佳液化條件的苦蕎液化液為研究對象，根據以上苦蕎酒糖化條件的單因素試驗結果，設計四因素三水平的正交試驗，以還原糖含量為考核指標，確定糖化最優試驗組合。

1.3.6 苦蕎酒發酵條件的單因素試驗設計

1.3.6.1 苦蕎酒發酵pH值的確定

將經過液化和糖化后的料液，用2mol/L檸檬酸分別調節其pH值至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，然后添加0.1%的安琪酵母，在28℃的條件下發酵72h，通過比較其酒精度和黃酮含量來確定發酵初始pH值。

1.3.6.2 苦蕎酒發酵酵母菌添加量的確定

將經過液化和糖化后的料液，用2mol/L檸檬酸調節其pH值至4.5，然后分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.30%的安琪酵母，在28℃的條件下發酵72h，通過比較其酒精度和黃酮含量來確定酵母菌的添加量。

1.3.6.3 苦蕎酒發酵溫度的確定

將經過液化和糖化后的料液，用2mol/L檸檬酸調節其pH值至4.5，然后添加0.1%的安琪酵母，分別置于20、24、28、32、36℃的條件下發酵72h，通過比較其酒精度和黃酮含量來確定最適發酵溫度。

1.3.6.4 苦蕎酒發酵條件的正交試驗設計

以1.3.4、1.3.5節得到的最佳液化條件和最佳糖化條件的苦蕎液為研究對象，根據以上苦蕎酒發酵條件的單因素試驗結果，設計三因素三水平的正交試驗，以酒精度及黃酮含量為考核指標，確定發酵最優試驗組合。

1.4 數據分析

采用Origin Pro8.6軟件對單因素和正交試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 苦蕎酒液化最佳工藝條件的確定

2.1.1 溫度對液化液DE值的影響

圖1 液化溫度對液化液DE值的影響Fig.1 Effect of liquefaction temperature on DE

由圖1可知，當溫度為60℃時，液化液DE值達到最大，即α-淀粉酶對液化液的水解程度達到最高。當溫度小于60℃時，液化液DE值隨著溫度的升高而顯著增加（P＜0.05）；當溫度大于60℃時，隨著溫度的增加，液化液DE值顯著下降（P＜0.05）。這是因為溫度對α-淀粉酶的活性存在影響，在適宜溫度范圍內，隨著溫度的升高，反應速度加快，一旦超過最適溫度范圍，α-淀粉酶的活性逐漸降低甚至喪失，反應速率下降。因此，液化的最適溫度為60℃。

2.1.2 pH值對液化液DE值的影響

圖2 pH值對液化液DE值的影響Fig.2 Effect of liquefaction pH on DE

由圖2可知，當pH值為7時，液化液DE值達到最大，即α-淀粉酶對液化液的水解程度達到最高。當pH值小于7時，液化液DE值隨著pH值的升高而顯著增加（P＜0.05），當pH值大于7時，隨著pH值的升高，液化液DE值顯著下降（P＜0.05）。這是因為pH值對α-淀粉酶的活性存在影響，pH值過高或過低都會改變酶的活性中心構象[20]，即酶只在最適的pH值范圍內才能表現出最大活力。在適宜pH值范圍內，隨著pH值的升高，反應速度加快，一旦超過最適pH值范圍，α-淀粉酶的活性逐漸降低甚至喪失，反應速率下降。因此，液化的最適pH值為7。

2.1.3 液化時間對液化液DE值的影響

圖3 液化時間對液化液DE值的影響Fig.3 Effect of liquefaction time on DE

由圖3可知，當液化時間小于2h時，液化液DE值隨著液化時間的增加顯著升高（P＜0.05），當液化時間大于2h時，隨著液化時間的增加，液化液DE值上升緩慢，不顯著（P＞0.05），趨于平穩。這是因為隨著液化的進行，液化液中短鏈淀粉產物逐漸增多，使得水解的速度變慢。α-淀粉酶對淀粉的液化可以分為兩個階段，開始時α-淀粉酶主要作用于直鏈淀粉，使其降解生成寡糖，淀粉液黏度下降，然后作用于支鏈淀粉，產生葡萄糖、麥芽糖以及α-限制糊精，同時使寡糖水解生成葡萄糖和麥芽糖[21]。因此，考慮到時間成本，以提高效率，液化的最適時間選為2h。

2.1.4 α-淀粉酶添加量對液化液DE值的影響

圖4 α-淀粉酶添加量對液化液DE值的影響Fig.4 Effect of amount of α- amylase used for liquefaction on DE

由圖4可知，當α-淀粉酶添加量小于0.15%時，液化液DE值隨著α-淀粉酶添加量的增多而顯著增大（P＜0.05）；當α-淀粉酶添加量大于0.15%時，液化液DE值隨著α-淀粉酶添加量的增加不顯著（P＞0.05），逐漸趨于平穩。α-淀粉酶屬于內切酶，可以水解淀粉分子結構內部的α-1,4糖苷鍵，但較難水解位于分子末端的α-1,4糖苷鍵，且不能水解α-1,6糖苷鍵，從而，隨著液化時間的延長，DE值基本不再變化。因此，從節約酶用量和降低生成成本角度考慮，液化的最適α-淀粉酶添加量為0.15%。

2.1.5 苦蕎酒液化的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計以下四因素三水平的正交試驗，實驗結果見表1。

表1 液化正交試驗結果Table1 Orthogonal array design and results for the optimization of liquefaction conditions

由表1可知，各因素對苦蕎酒液化DE值的影響次序為D＞C＞A＞B，即α-淀粉酶添加量＞時間＞pH值＞溫度。苦蕎酒液化的最優組合為A2B3C3D3，但是此組合未在9組實驗中出現，因此需要對該組合做驗證實驗。通過驗證實驗，在此最佳組合下得到的DE值為25.43%，高于9組試驗，因此，苦蕎酒液化的最佳條件為：α-淀粉酶添加量為0.15%、溫度60 ℃、pH 6.5、液化時間2.5 h。

2.2 苦蕎酒糖化最佳工藝條件的確定

2.2.1 糖化pH值對糖化液還原糖含量的影響

圖5 糖化pH值對糖化液還原糖含量的影響Fig.5 Effect of saccharification pH on reducing sugar content

由圖5可知，當pH＜4.5時，還原糖含量隨著pH值的升高而升高；當pH＞4.5時，還原糖含量隨著pH值的再度升高而降低；當pH值為4.5時，還原糖含量達到最大，為10.53%。這是因為pH值影響糖化酶的活性，pH值過低或過高都會導致酶變性，從而降低糖化酶的活性，甚至失活。因此，最適糖化pH值為4.5。

2.2.2 糖化溫度對糖化液還原糖含量的影響

圖6 糖化溫度對糖化液還原糖含量的影響Fig.6 Effect of saccharification temperature on reducing sugar content

由圖6可知，當溫度低于60℃時，隨著溫度的升高還原糖含量顯著增加（P＜0.05）；當溫度超過60 ℃時，還原糖含量隨著溫度的升高而降低；當溫度為60 ℃時，還原糖含量達到最大值。這是因為當溫度超過60 ℃時，糖化酶的活性逐漸降低，因此，最適糖化溫度為60 ℃。

2.2.3 糖化時間對糖化液還原糖含量的影響

圖7 糖化時間對糖化液還原糖含量的影響Fig.7 Effect of saccharification time on reducing sugar content

由圖7可知，當糖化時間小于2.5 h時，糖化液還原糖含量隨著糖化時間的延長而顯著升高（P＜0.05）；當糖化時間長于2.5 h時，還原糖含量隨著糖化時間的延長逐漸趨于平穩（P＞0.05）。因此，考慮到時間成本，以提高效率，糖化最適時間為2.5 h。

2.2.4 糖化酶添加量對糖化液還原糖含量的影響

圖8 糖化酶添加量對糖化液還原糖含量的影響Fig.8 Effect of glucoamylase amount on reducing sugar content

由圖8可知，當糖化添加量小于0.5%時，糖化液還原糖含量隨著糖化酶添加量的增多而顯著增大（P＜0.05）；當糖化酶添加量大于0.5%時，糖化液還原糖含量升高幅度緩慢，趨于平衡（P＞0.05）。因此，從節約酶用量和降低生成成本角度考慮，糖化最適糖化酶添加量為0.5%。

2.2.5 苦蕎酒液化的正交試驗

表2 糖化正交試驗結果Table2 Orthogonal array design and results for the optimization of saccharification conditions

由表2可知，各因素對還原糖含量的影響次序為B＞C＞D＞A，即溫度＞時間＞糖化酶添加量＞pH值。分析得出還原糖含量對苦蕎酒糖化的最優組合均為A3B2C3D3，但是此組合未在9組試驗中出現，因此需要對該組合做驗證實驗。通過驗證實驗，在此最佳組合下得到的還原糖含量為13.32%，高于9組試驗，因此，苦蕎酒糖化的最佳條件為：糖化酶添加量為1.5%、溫度60℃、pH5.0、糖化時間3h。

2.3 苦蕎酒發酵最佳工藝條件的確定

2.3.1 酵母菌添加量對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響

圖9 酵母菌添加量對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響Fig.9 Effect of yeast inoculum size on the contents of alcohol and flavonoids in tartary buckwheat wine

由圖9可知，當酵母菌添加量為0.1%時，苦蕎酒的酒精度及黃酮含量均達到最大；當酵母菌添加量小于0.1%時，苦蕎酒的酒精度和黃酮含量逐漸增大，這是因為當酵母菌添加量過小的時候，發酵液中的原料糖分不能被酵母菌充分利用，發酵不完全；而當酵母菌添加量大于0.1%時，苦蕎酒的酒精度和黃酮含量逐漸降低，這是因為酵母菌添加量過大時，酵母菌會利用發酵液中的糖分用于自身生長，而用于產酒精的底物濃度降低，且當酵母菌添加過多時，微生物繁殖過快，也會消耗發酵液中的糖分，使得最終酒精度較低。因此，最適酵母菌添加量為0.1%。

2.3.2 pH值對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響

圖10 pH值對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響Fig.10 Effect of fermentation pH on contents of alcohol and flavonoids in tartary buckwheat wine

由圖10可知，當pH值為4.5時，苦蕎酒的酒精度與黃酮含量達到最大。當pH＜4.5時，隨著pH值的增加，酒精度與黃酮含量逐漸增加。當pH＞4.5時，隨著pH值的逐漸增大，酒精度與黃酮含量逐漸降低。這是因為當pH值過低時，酵母菌的代謝能力受到影響，發酵速度減慢，不利于發酵；而當pH值過高時，雜菌繁殖不受抑制，影響最終酒的風味，且使得酒精度降低。綜合考慮，苦蕎酒最適發酵pH值為4.5。

2.3.3 發酵溫度對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響

由圖11可知，當發酵溫度為28 ℃時，所得苦蕎酒的酒精度與黃酮含量達到最大；而當溫度低于28 ℃時，隨著溫度的升高，苦蕎酒的酒精度與黃酮含量均逐漸升高；當溫度高于28 ℃時，隨著溫度的升高，苦蕎酒的酒精度與黃酮含量均逐漸降低。這是因為，當溫度對微生物的生長有很大的影響，當溫度較低時，酵母菌代謝能力較弱，不能充分利用發酵液中的糖分進行酒精發酵，而當溫度較高時，酵母菌的發酵速率較快，會提前導致酵母菌老化，且殘糖量高，酒精產量低。因此，綜合考慮苦蕎酒發酵的最適溫度為28 ℃。

圖11 溫度對苦蕎酒酒精度及黃酮含量的影響Fig.11 Effect of fermentation temperature on the contents of alcohol and flavonoids in tartary buckwheat wine

2.3.4 苦蕎酒發酵的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計以下三因素三水平的正交試驗，結果見表3。

表3 苦蕎酒發酵正交試驗結果Table3 Orthogonal array design and results for the optimization of fermentation conditions

由表3可知，各因素對苦蕎酒發酵酒精度的影響次序為C＞B＞A，即發酵溫度＞發酵pH值＞酵母菌的添加量，對黃酮含量的影響次序為A＞B=C，即酵母菌的添加量＞發酵pH值=發酵溫度。分析得出二指標對苦蕎酒發酵的最優組合均為A1B2C1，但是此組合在9組試驗中未出現，因此需要對該組合做驗證實驗。通過驗證實驗，在此最佳組合下得到的酒精度為8.9°，黃酮含量為0.94 mg/L高于9 組試驗，因此，苦蕎酒發酵的最佳條件為：酵母菌添加量為0.1%、溫度28 ℃、pH 4.5。

2.4 最優條件下苦蕎酒基本理化指標測定結果

表4 苦蕎酒基本理化指標Table4 Basic physical and chemical indicators of tartary buckwheat wine

由表4可知，苦蕎成品酒各指標均達到黃酒相關標準，其中酒精度約為8.9°，功能因子總黃酮含量達到0.94mg/L左右，氨基酸態氮的含量也大于黃酒標準，因此，苦蕎酒總體符合黃酒相關標準。

3 結 論

通過對苦蕎酒釀造工藝的研究，確定了最佳液化工藝條件為：α-淀粉酶添加量0.15%、pH 6.5、溫度60 ℃、液化時間2.5 h；最佳糖化最佳工藝條件為：糖化酶添加量1.5%、pH 5、溫度60 ℃、糖化時間3 h；最佳發酵工藝條件為：酵母添加量0.1%、發酵溫度28 ℃、pH 4.5。所得最優工藝條件下的苦蕎酒相關指標符合國家相關標準。

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Optimization of Liquid-State Fermentation Conditions for Buckwheat Wine

CHEN Jia-xin, ZHAO Xiao-juan, WU Jun, DU Mu-ying*
(Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

This study reports the production of tartary buckwheat wine from liquid-state fermentation of tartary buckwheat from Youyang, Chongqing municipality. We optimized the process conditions using single-factor and orthogonal array designs. The best liquefaction results were obtained by enzymatic treatment for 2.5 h using α-amylase at pH 6.5 and 60 ℃with an enzyme dosage of 0.15%. The best saccharification conditions were achieved by allowing the hydrolysis process catalyzed by 1.5% glucoamylase at pH 5.0 and 60 ℃ to proceed for 2.5 h. The best fermentation conditions were determined as 0.1% yeast inoculum size, pH 4.5 and 28 ℃. After 72 h of fermentation under these optimized conditions, tartary buckwheat wine with an alcohol content of approximately 9% by volume was obtained.

tartary buckwheat wine; liquid-state fermentation; liquefaction; saccharification; fermentation

TS261.4

A

1002-6630（2014）11-0129-06

10.7506/spkx1002-6630-201411026

2013-07-19

中國-匈牙利政府間科技合作項目（國科外字[2013]83號，No：6-30）

陳佳昕（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：331956701@qq.com

*通信作者：杜木英（1972—），女，副教授，博士，研究方向為微生物與發酵工程。E-mail：muyingdu@swu.edu.cn