醒腦丸對氣虛血瘀血管性癡呆大鼠的治療作用研究

徐海蓉

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

血管性癡呆(VD)是腦血管病(CVD)后發生的進行性智能障礙綜合征，發病率各國報道不一致，在老年癡呆中歐美占15% ～50%，亞洲占60% ～80%[1]。我國11 個城市和農村普查結果顯示，大于60 歲人群的患病率為324/10 萬，城市人群為428/10 萬，農村人群為140/10 萬[2]。血管性癡呆的發病率與年齡呈正相關，其中大于60 歲者占79.53%[3]，25% ～50%的腦血管病最終導致血管性癡呆。腦梗死癡呆發生率為13.6%，大于出血性癡呆的2.69%，其中多發梗死性癡呆(MID)占15% ～68.7%[4]。雖然現代醫學對血管性癡呆的病因病理認識已比較明確，但尚無特效的治療方法，而中醫復方具有整體調節，多層次、多方位、多靶點作用，毒副作用小等特點。為此，本研究中初步探討了中藥醒腦丸對血管性癡呆的治療作用及機理。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD 大鼠48 只，雄性，體重(200 ±20)g，由南京君科生物科技有限公司提供，符合國際動物倫理學標準。醒腦丸(哈藥集團世一堂制藥廠，國藥準字Z23020166，規格為每丸9 g)主要由黃芪、西洋參、當歸、川芎、水蛭、地龍、三七、菖蒲、遠志、冰片等組方，將藥丸溶解、過濾至含生藥1 g/mL，置冰箱備用;腦復康片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，國藥準字H21021775，規格為每片0.4 g)，將藥片溶解制成0.032 g/mL 混懸液備用。大鼠血栓素B2(TXB2)ELISA 試劑盒(上海科敏生物科技有限公司);總一氧化氮(NO)試劑盒(碧云天生物研究所);大鼠Bax 免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)

1.2 方法

動物前期準備:大鼠購回后適應性喂養3 d，進行24 h 飲水量、24 h 食量、自發活動的測定。自發活動量化測定方法[5]，將自制的25 cm×25 cm×25 cm 的自發活動箱底部劃十字線，分為4等份，置安靜環境中，試驗前先撫摩動物2 min，使其熟悉試驗者，然后將大鼠置測定箱的一角，觀察3 min 內動物橫向和直向活動，以跨越劃線次數為橫向活動指標，以前肢抬起或后肢站立的次數為直向活動指標。第4 天開始，進行游泳勞損引起氣虛造模。14 d 后，再進行24 h 飲水量、24 h 食量、自發活動的測定。

造模:游泳勞損致氣虛模型，將大鼠放入水溫(43 ±0.5)℃、水深35 cm 的恒溫水槽中游泳，連續游泳14 d;以每只大鼠出現自然沉降的時間為大鼠游泳耐疲勞的時間，當全組50%的大鼠出現自然沉降時，全組動物停止游泳。全腦缺血模型，大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(每100 g 體重0.3 mL)，仰臥位固定，頸正中去毛，碘酒酒精消毒，行頸正中切口，鈍性分離肌肉及皮下組織，分別暴露雙側頸總動脈并用絲線結扎，逐層縫合，對齊皮膚;術后給予青霉素20 萬U 肌肉注射3 d，注意保持傷口清潔，分籠飼養。

分組:將氣虛造模成功的大鼠隨機分為4 組，即空白對照組(A 組)、模型組(B 組)、腦復康片組(C 組)、醒腦丸組(D 組)，每組12 只。

給藥:術后3 d，大鼠傷口愈合，飲食恢復后開始給藥，4 組均連續灌胃15 d，每天早晚各1 次。

A 組、B 組均以每次3 mL 生理鹽水灌胃，C 組以每次每1 kg體重腦復康片83 mg 溶于3 mL 生理鹽水中灌胃，D 組以每次每1 kg 體重醒腦丸0.83 g 體重溶于3 mL 生理鹽水中灌胃。

1.3 觀察指標

行為學指標:觀察大鼠造模及用藥后的機體狀態，如皮毛、活動量、舌質;大鼠學習獲得能力測試，術后21 d 時，4 組大鼠分別進行水迷宮試驗，水迷宮由中國醫學科學院藥物研究所研制，整個迷路設置4 個盲端，終點有一高出水面的安全臺，水深18 cm，水溫(25±2)℃;每天訓練2 次，記錄每只大鼠在游泳中進入盲端的次數及游出時間，在水迷宮中進入盲端的次數越少及游出的時間越短，表明動物學習記憶能力越強。采用ELISA 法檢測血漿TXB2含量，用硝酸還原酶法測定10%腦勻漿中NO 含量，光鏡下觀察海馬CA1 區神經元形態、數量，采用免疫組化法檢測大腦海馬促細胞凋亡蛋白Bax 表達。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 氣虛模型

與造模前比較，造模后大鼠24 h 飲水量、食量均明顯減少，自發活動量也降低，均有極顯著性差異(P ＜0.01)，提示游泳勞損致氣虛造模成功。見表1。

2.2 大鼠機體狀態比較

灌服藥物15 d 后觀察大鼠，A 組活動靈活，皮毛鮮亮有光澤，舌質淡紅;B 組自主活動減少，皮毛色黯不光滑，舌質紫黯;C 組自主活動有所增多，但皮毛色澤與舌質顏色與B 組基本相同;D組自主活動明顯增多(接近A 組)，皮毛光滑柔順、色澤鮮亮(與A組無明顯差異)，舌質較紅。

表1 氣虛模型評定結果( ± s)

表1 氣虛模型評定結果( ± s)

注:與造模前比較，＊P ＜0.01。

類別造模前(n=48)造模后(n=48)24 h 飲水量(mL)13.97 ±1.76 10.29 ±1.05＊24 h 食量(g)9.30 ±2.06 7.15 ±1.31＊自發活動(次)26.23 ±7.07 21.77 ±6.65＊

2.3 觀察指標測定

學習獲得能力:與A 組比較，B 組水迷宮到達終點時間明顯延長，進入盲端的錯誤次數明顯增多，學習能力下降，均有極顯著性差異(P ＜0.01)，提示癡呆模型造模成功。與B 組比較，C 組和D 組到達終點時間均明顯縮短(P ＜0.01)，D 組進入盲端的錯誤次數明顯減少(P ＜0.01)，提示中藥醒腦丸可提高血管性癡呆大鼠的學習獲得能力。見表2。

血漿TXB2含量:與A 組比較，B 組血漿TXB2含量明顯升高(P ＜0.01)，提示氣虛血瘀征象明顯，造模基本成功。與B 組比較，C 組血漿TXB2含量無明顯變化(P ＞0.05)，D 組則明顯降低(P ＜0.05)，提示醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠TXB2含量，穩定血小板功能，改善氣虛血瘀征象。見表2。

腦組織NO 含量:與A 組比較，B 組腦組織NO 含量明顯升高(P ＜0.01)，提示造模基本成功。與B 組比較，C 組和D 組腦組織NO 含量均降低，D 組降低更明顯(P ＜0.01)，提示醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠腦組織NO 含量，減少過量NO 的毒性作用，減輕腦缺血后期神經元的損害。見表2。

表2 各組大鼠觀察指標測定結果( ± s，n=9)

表2 各組大鼠觀察指標測定結果( ± s，n=9)

注:與A 組比較，＊P ＜0.01;與B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 學習獲得能力 血漿TXB2 含量(pg/mL)腦組織NO 含量(μmol/L)A 組B 組C 組D 組到達終點時間(s)62.75±15.94 132.00±30.38＊66.50±16.20▲65.75±20.01▲錯誤次數(次)1.38±1.06 3.88±1.13＊2.50±1.07△1.63±0.92▲708.21±250.90 1 185.02±198.63＊1 058.22±329.44 872.13±211.25△5.56±1.32 9.08±2.30＊6.46±1.22△6.00±1.75▲

2.4 海馬CA1 區神經元形態學觀察

A 組海馬CA1 區結構完整，神經元形態、數目正常，錐體細胞排列整齊;B 組海馬CA1 區結構不完整，錐體細胞排列紊亂，神經元數目明顯減少，部分細胞周圍出現間隙，細胞脫失明顯，膠質細胞大量增生形成結節;C 組海馬CA1 區結構欠完整，錐體細胞排列不整齊，神經元數目減少，但較B 組多，細胞有脫失，膠質細胞增生明顯;D 組海馬CA1 區結構較完整，錐體細胞排列基本整齊，神經元數目較B 組增多，細胞脫失較少，膠質細胞輕度增生。見圖1。結果提示，醒腦丸對海馬CA1 區神經元的損傷有保護作用。

2.5 大腦海馬促細胞凋亡蛋白Bax 的表達

Bax 免疫陽性細胞呈黃褐色，未加Bax 抗體的陰性對照為淡藍色。在A 組中，非缺血大鼠的海馬區極少見Bax 免疫陽性細胞，僅存在于個別皮層區域，且從形態學上看出，此表達局限于錐體細胞和中間神經元中。而在B 組中，可發現海馬CA1 及CA4 區出現明顯的Bax 免疫陽性反應;腦皮層也呈現與海馬區類似的Bax免疫陽性反應，呈散在較均勻地分布。C 組Bax 的表達較B 組有一定減少。D 組Bax 的表達明顯減少，特別是海馬CA1 區及大腦皮層區。見圖1。結果提示，醒腦丸能下調腦缺血后Bax的表達，從而發揮其抗細胞凋亡的神經保護作用。

圖1 各組大鼠海馬CA1 區神經元形態學光鏡圖

3 討論

中醫對癡呆的認識，早在先秦時期《左傳》中就有“不慧，蓋世所謂白癡”的記載，漢代華佗始稱之為“癡呆”，此后亦有愚癡、癡證、呆癡、呆病、神呆等不同名稱[6]。其成因在《醫林改錯》中已有“靈機記性在腦，年高無記性者，腦髓漸空”的概述，并說明癡呆與腦髓充盈的程度有直接關系，即腦髓充盈則人的腦神具有靈性智慧，神機聰穎，否則神機衰退以至不慧而成癡呆。

中風癡呆是癡呆的一個重要類型，其發病于中風之后，出現“迷惑善忘”“言善誤”“語無倫次”“懈怠安臥”“苦憂悲”等一系列精神異常癥狀。《金匱要略·中風歷節病》:“邪入于腑，即不識人。”《臨證指南醫案·中風》:“或風陽上僭，痰火阻竅，神識不清……”，均明言中風時神志受累之實[7]。中風癡呆的發病機制，不可脫離“年老體衰”“發于中風”這兩個特點。

血管性癡呆的發生與腦動脈硬化、頸內動脈閉塞及基底動脈硬化關系密切[8]。本病病因為內有所傷，外有所擾。人至老年，體力漸衰，五臟皆虛，尤其是心、腎、脾、胃等臟氣虧虛，則腦髓漸空，復因將息失宜、煩勞過度等，致使人體陰陽失調、氣虛血瘀、腦絡不通、腦脈失養、神明失用，遂癡呆、善忘。病性為本虛標實，五臟氣虛為本，瘀血閉阻腦脈為標，虛瘀并見，以益氣養血、活血化瘀為其治療的有效方法。

醒腦丸方中，黃芪大補元氣，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷正;西洋參助黃芪補氣，有人參之功，無溫燥之弊，補氣而不傷陰，與黃芪共為君藥;當歸為臣，能補血又能行血，可攻可補，有祛瘀而不傷好血之妙;川芎、三七活血化瘀，地龍通絡之功無處不到，水蛭性寒、入血分而長于逐瘀、性遲緩則不傷正氣，菖蒲、遠志化痰開竅、安神益智，共為佐藥;冰片為使，香竄善行，通諸竅更能清心醒腦。全方構思周密、精巧，共奏益氣活血開竅之功[9]。

現代藥理研究證明[10]，黃芪能加強學習記憶能力，有利于大腦對信息的貯存作用。黃芪總黃酮可降低細胞脂質過氧化物的生成，升高細胞超過氧化物歧化酶(SOD)的活性，維持細胞正常代謝。西洋參可調節大腦皮層的興奮、抑制過程，西洋參莖葉皂苷能增加循環血容量，減少休克時去甲腎上腺素的合成和釋放，從而改善微循環的灌流狀態，顯示出良好的全身性抗缺氧作用。當歸能明顯改善大鼠試驗性腦缺血癥狀，抑制TXB2產生，糾正腦缺血血檢素A2/前列環素I2(TXA2/PGI2)比值，對急性腦缺血大鼠具有明顯的治療作用。當歸、黃芪均能抑制大鼠血小板聚集，二者合用時作用更強，具明顯的協同作用。川芎嗪可通過血腦屏障，能抗血栓形成，顯著減輕兔腦組織缺血性損害和神經系統功能障礙。水蛭可明顯增加腦血流量，給試驗性腦水腫的家兔靜脈注射水蛭水提醇沉液，可減少腦切片的血腫面積、促進腦血腫吸收。地龍提取液能明顯延長血小板血栓和纖維蛋白血栓的形成時間，減少血栓長度和干重。三七能抑制血小板聚集，降低血液黏度，能阻止再灌注時Ca2+內流，對腦缺血損傷起保護作用。三七莖葉皂苷能提高腦組織SOD 活性，起到抗衰老作用。菖蒲水、醇提取物對中樞神經系統有鎮靜作用，并能明顯促進正常小鼠的記憶獲得，并可對抗亞硝酸鈉或乙醇對記憶的不良作用。

本研究結果表明，醒腦丸能有效抑制腦缺血時體內血小板的激活，降低血漿TXB2的水平，減輕微循環障礙，提示醒腦丸對缺血性腦血管病具有積極的防治作用，對氣虛血瘀的病理狀態有明顯改善作用。同時，醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠腦組織NO 含量，減少過量NO 的毒性作用，減輕腦缺血后期神經元的損害，這可能是醒腦丸治療血管性癡呆的作用機理之一。

本研究中，血管性癡呆大鼠腦切片用HE 染色后，光鏡結果證實了缺血對海馬的損傷，也表明了醒腦丸對血管性癡呆大鼠海馬CA1 區神經元的缺血性損傷具有保護作用，這可能是該藥治療血管性癡呆的主要作用機制之一。采用免疫組織化學方法研究發現，應用醒腦丸后，Bax 免疫陽性細胞數目明顯減少，證實醒腦丸能下調腦缺血后Bax 蛋白的表達，從而發揮其抗細胞凋亡的神經保護作用。但關于醒腦丸對缺血后腦細胞中Bax 的表達發揮調節作用的確切機制尚待進一步研究。

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