杜仲炮制前后綠原酸含量的毛細管區帶電泳研究

張 英，王淑敏

(1. 內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059; 2. 長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

杜仲為杜仲科落葉喬木植物杜仲Ecommia ulmoides Olliv. 的樹皮，所含綠原酸為主要成分[1]。目前，杜仲化學成分的分析方法主要有紫外可見分光光度法、高效液相色譜(HPLC)法、薄層色譜(TLC)法、紙層-紫外分光光度法等[2-4]，其中HPLC 法較常用。與HPLC 相比，毛細管電泳法具有分離速度快、分離效率高、樣品及試劑消耗量少和毛細管柱壽命長且容易清洗等優點，近年來在中藥有效成分分析中逐漸得到應用推廣[5-6]。本試驗中建立了測定杜仲中綠原酸含量的毛細管區帶電泳(CZE)方法，并對炮制前后杜仲中綠原酸含量的變化規律進行了系統研究?，F報道如下。

1 儀器與試藥

Beckman Counter P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System高效毛細管電泳儀;彈性石英毛細管(75 μm×50 cm，河北永年光纖廠);pHS-3B 型酸度計(上海雷磁儀器廠)。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110753-200212，供含量測定用);杜仲購于四川江柚藥材公司，經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為Ecommia ulmoides OLliv. 的干燥樹皮;其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 測試條件

紫外檢測波長327 nm;分離電壓25 kV，靜壓力進樣(高度10 cm，時間5 s);背景電解質為30 mmol/L 硼砂緩沖溶液(用0.2 mol/L醋酸和0.1 mol/L NaOH 調pH 至9.0)，使用前超聲脫氣10 min，毛細管使用前用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L硼砂緩沖溶液各清洗10 min，每次電泳后分別用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L 硼砂緩沖溶液清洗2，3，5 min。

2.2 溶液制備

稱取綠原酸對照品0.48 mg，精密稱定，置2 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取50，100，150，200，250 μL，置2 mL 容量瓶中，作為對照品溶液，使用前用0.45 μm 醋酸濾膜過濾;鹽炮制品為杜仲生品用2%(g/g)鹽水燜透后，在一定溫度下烘干所得。取杜仲生品及鹽炮制品(剪成均勻碎片)2 g，置錐形瓶中，精密稱定，加50%甲醇溶液15 mL，精密稱重，超聲30 min，超聲溫度25 ℃，用50%甲醇補足質量，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 測定條件優化

緩沖溶液與溶液pH:考察了pH 為7.0 ～9.5 范圍內pH 對電泳遷移的影響規律。結果表明，隨著pH 的增加，兩種分析物的遷移時間隨之增加，分辨率也增加?？赡苁怯捎陔S著pH 的增加，電滲流和分析物電泳遷移速度雖同時增加，但兩者方向相反，前者增加的程度大于后者的緣故。分別對對照品及實際樣品進行了研究，結果表明，當pH≥9.0 時，能實現綠原酸的良好分離，因此確定pH=9.0 為最佳緩沖溶液的酸度。在10 ～50 mmol/L 范圍內研究了緩沖溶液濃度對電泳分離的影響規律。結果表明，隨著緩沖溶液濃度的增加，分析物的遷移時間增加，分離度提高。考慮到緩沖溶液濃度過高會使焦耳熱效應明顯，造成基線噪音增加，影響檢測，故選擇30 mmol/L 的硼砂緩沖溶液。

工作電壓:在20 ～30 kV 范圍內研究了工作電壓的影響。結果表明，在20 ～30 kV 范圍內，兩種分析物峰高變化很小，兩種分析物的遷移時間和分辨率均隨著工作電壓的升高而降低。同時，隨著工作電壓的升高，基線噪音增加，使檢測靈敏度降低，當工作電壓超過25 kV 后，這種影響變得明顯。綜合考慮分離度、峰高和靈敏度等因素，確定工作電壓為25 kV。

進樣時間:在3 ～8 s 范圍內研究了進樣時間的影響。結果表明，隨著進樣時間增加，分析物峰高、峰寬均增加。當進樣時間超過5 s 后，峰高變化減慢，但峰展寬加劇，故確定進樣時間為5 s。

有機溶劑:考察了緩沖溶液中乙腈含量對分離的影響規律。結果表明，隨著緩沖溶液中乙腈濃度從5%到30%的增加，綠原酸的遷移時間呈增長趨勢。這主要是因為有機溶劑乙腈的加入，使得電滲流降低;此外，有機溶劑的加入，提高了杜仲樣品中某些化學成分的吸收。但當緩沖溶液中乙腈含量高于20%時，綠原酸的遷移時間達20 min 以上，對快速分析不利。因此，確定采用含有20%乙腈的緩沖溶液(即30 mmol/L 的硼砂+20%的乙腈)作為最佳分析條件。

2.3.2 線性范圍、重復性和檢出限試驗

在上述優化的測定條件下，綠原酸在12 min 內能實現良好分離，分離的電泳圖譜見圖1。對分析物的線性關系進行了系統研究，結果表明，綠原酸質量濃度在0.06 ～0.30 g/L 范圍內與峰面積呈良好線性關系，線性回歸方程為 Y=84 795 X+689.3(r=0.999 4)。還對方法重復性進行了考察，結果綠原酸遷移時間和峰面積的RSD 分別為1.91%和2.30%(n=5)。利用3 倍噪音法，測得綠原酸的檢出限為0.015 g/L。

2.3.3 加樣回收試驗

取杜仲生品適量，精密稱定，準確加入一定量的綠原酸對照品，按供試品溶液制備待測溶液，依法進樣測定，計算回收率。結果見表1，表明該方法用于杜仲的測定是準確、可靠的。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果(n=5)

2.4 樣品測定

利用所建立的方法，分析了杜仲生品和炮制品中綠原酸含量的變化情況，電泳圖譜見圖1B 和圖1C。結果杜仲生品和炮制品中綠原酸含量分別為0.118%和0.130%(n=3)?？梢?，杜仲經鹽水炮制后綠原酸含量增加了10.17%，這從化學成分方面對杜仲炮制后入藥進行了科學的解釋。

圖1 毛細管區帶電泳圖

3 討論

通過優化分離條件，建立了分析杜仲中綠原酸的毛細管區帶電泳法，即電泳緩沖液為pH =9.0 的30 mmol /L 硼砂溶液加入20%乙腈的溶液，分離電壓為25 kV，進樣時間為5 s。實際樣品分析及加樣回收試驗結果表明，該方法快速、準確、可靠，為杜仲藥材和含有杜仲藥材的藥物的質量控制提供了有效的的分析方法。

利用所建立的方法對炮制前后杜仲中綠原酸含量進行分析，結果表明，杜仲經炮制后綠原酸含量明顯增加，說明在炮制過程中杜仲的主要有效化學成分含量發生了變化。因此，杜仲炮制對其臨床應用具有重要意義。

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