正交試驗法優(yōu)選丹倍消瘢軟膏中阿魏酸提取工藝＊

朱 萍，張敏捷，蘇 平，陳 萍

(1. 陜西中醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046; 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003)

丹倍消瘢軟膏由川芎、五倍子、白芷等藥物組方，具有活血化瘀、軟堅散結、通絡止痛的功效，用于痔手術愈合后瘢痕組織所致肛門排便不適、瘢痕性肛管狹窄。川芎主要含阿魏酸、川芎嗪等有效成分[1]。阿魏酸具有抑制血小板聚集及抗菌消炎，解除血管平滑肌痙攣，抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫等藥理作用[2-3]。筆者參考文獻[4 -5]，采用乙醇回流的提取方法，以出膏率和阿魏酸的含量為考察指標，優(yōu)選丹倍消瘢軟膏中阿魏酸的最佳提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2690 型高效液相色譜儀;Anke TDL-60B 型高速離心機(上海安亭科學儀器廠);UV-1700 型紫外可見分光光度計(上海鳳凰光學科儀有限公司);101 型電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);KEWE 型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);BP211D 型電子分析天平(德國賽多利斯)。川芎、五倍子、白芷藥材均購自中國藥材公司;阿魏酸對照品(供含量測定用，批號為0773-9910，中國藥品生物制品檢定所);乙腈(Fisher)為色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 吸濕率考察

稱取10 倍處方量藥材，每隔1 h，加入8 倍量70%乙醇溶液浸泡，過濾，去濾液，稱重1 次，4 h 后質量基本恒定。結果見表1。

表1 藥材吸濕率考察結果

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Boston Green ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸(19 ∶81);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL;檢測波長:321 nm。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL 含25.88 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密移取樣品提取液各5 mL，置離心機中，以4 000 r/min 的速率離心10 min 后，取出，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。將制得的樣品溶液按擬訂色譜條件進樣，其色譜圖見圖1。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察:精密吸取對照品溶液4，8，12，16，20 μL，按擬訂色譜條件，以阿魏酸進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=9 568 X-100 092，r=0.999 8(n=5)。結果表明，阿魏酸進樣量在0.015 76 ～0.157 6 μg 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，結果峰面積平均值為512 149，RSD 為1.92%;精密吸取同一批供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6次，結果峰面積平均值為491 608，RSD 為3.2%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，8，12 h 時進樣。結果峰面積的RSD 為4.9% ( n=7)，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批樣品，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果阿魏酸含量平均值為0.262‰，RSD 為4.2% ( n=6)，表明方法重復性良好。

圖1 阿魏酸高效液相色譜圖

加樣回收試驗:取已知含量的樣品9 份，精密稱定，分別加入一定量的阿魏酸對照品溶液，依法測定。結果見表2。

表2 阿魏酸加樣回收試驗結果(n=9)

2.3 醇提工藝考察

2.3.1 因素與水平確定

醇提取工藝中對提取率影響較大的因素有乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)，按正交試驗L9(34)設計了正交試驗因素水平表，詳見表3。

表3 正交試驗因素水平表

2.3.2 正交試驗與結果

按處方比例稱取藥材，共9 份，置500 mL 圓底燒瓶中，浸泡4 h 后，分別按L9(34)設計表的安排進行回流提取，濾過，合并濾液，精密量取提取液100 mL，置已干燥至恒重的1 ～9 號蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算出膏率，結果見表4。

精密吸取1 ～9 號供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定阿魏酸的含量，結果見表4，方差分析見表5。由表4 和表5 可見，4 個因素的影響大小順序為D ＞A ＞C ＞B，即提取次數(shù)為最大影響因素，其次為乙醇濃度、提取時間和加醇量;得最佳提取工藝為A2B2C2D3，即以70%乙醇提取3 次，第1 次用5 倍量提取1.5 h，第2 次用4 倍量提取1.0 h，第3 次用4 倍量提取1.0 h。

表4 正交試驗結果( n=9)

表5 方差分析結果

2.3.3 最佳工藝驗證試驗

按處方比例稱取藥材3 份，按優(yōu)選的提取工藝進行平行試驗，測得出膏率分別為19.45%，20.02%，19.78%，阿魏酸含量分別為0.29‰，0.30‰，0.29‰，說明優(yōu)選工藝條件合理、穩(wěn)定。

3 討論

本研究采用正交試驗法，以出膏率和阿魏酸的提取量為考察指標，采用權重系數(shù)進行加權求和，綜合地評定丹倍消瘢軟膏中阿魏酸提取工藝，具有一定的科學性與合理性。本試驗參考文獻[6]的色譜條件，采用乙腈-磷酸溶液作為流動相，采用了乙腈-0.085%磷酸溶液(17 ∶83)、乙腈-0.1%磷酸溶液(18 ∶82)等多次試驗，確定最佳條件為乙腈-0.1%磷酸(19 ∶81)。結果表明，本方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，準確度高，為該制劑的質量控制提供了一種快速、準確的方法。

本研究的不足之處在于，以阿魏酸作為指標成分進行含量測定，具有一定的片面性，不能完全代表該復方的藥效，故在以后的研究中應綜合考慮其他有效成分進行進一步研究。

[1] 金 月，李 江.RP-HPLC 法測定川芎藥材中阿魏酸的含量[J]. 西北藥學雜志，2010，25(2):85 -87.

[2] 梁 艷，程喜樂. 高效液相色譜法測定清腦降壓顆粒中阿魏酸含量[J]. 中國藥業(yè)，2013，22(24):34 -35.

[3] 蔡翠芳，唐 星，李積軍. 川芎中阿魏酸的提取純化工藝[J]. 沈陽藥科大學學報，2008，25(1):70 -76.

[4] 白海波，王劍飛，宋子榮，等. 川芎提取工藝的優(yōu)化[J]. 中國實驗方劑學雜志，2003，9(4):8 -10.

[5] 楊廣德，梁明金，賀浪沖，等. 川芎中阿魏酸的提取方法研究[J]. 中成藥，2002，24(6):418 -420.

[6] 孫 蕓，葛 亮，劉俊昌，等. 膝痹膏方中當歸的提取工藝[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32(9):686 -688.