吳茱萸生物總堿提取條件的優化設計＊

吳方評，蒲艷春，楊 勇，楊宏健

(懷化醫學高等專科學校，湖南 懷化 418000)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果實，主要分布于貴州、廣西、湖南等地，有散寒止痛，降逆止吐，助陽止瀉之功效[1]，臨床常用于治療高血壓、疼痛、腹瀉、嘔吐等癥[2-5]。吳茱萸含有多種化學成分，目前從中提取的主要有揮發油、苦味素和生物堿等。現代藥理學研究認為，吳茱萸堿、吳茱萸次堿是吳茱萸中的重要藥理活性成分，具有保護心臟[6-8]、抑制血栓形成[9]、抗癌[10]和抗菌[11]等作用。鑒于吳茱萸堿、吳茱萸次堿的生物活性，許多學者對其進行了大量提取方法的探索，但所用方法普遍存在工藝復雜、溶劑消耗量大、提取成本高等缺點。由于微波提取具有其他方法不可比擬的優勢，本試驗中優選了吳茱萸生物總堿的最佳提取條件，現報道如下。

1 儀器與試藥

MENS 型中藥微波萃取儀;Agilent 1200 型單元泵高效液相色譜儀;可變波長檢測器;FA2004 型電子天平(上海方瑞儀器有限公司);索式提取器;干燥器等。吳茱萸堿對照品(批號為110802 -200606)、吳茱萸次堿對照品(批號為110801 -201006)，均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)均為色譜純;石油醚、無水乙醇(天津市富宇精化工有限公司)均為分析純;二次蒸餾水。共收集不同產地的吳茱萸果實5 批，經專家鑒定，均為蕓香科植物吳茱萸的成熟果實。不同產地的吳茱萸樣品信息見表1。

表1 不同產地樣品信息

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB - C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:水-甲醇-乙腈(42 ∶20 ∶38);進樣量:20 μL;流速:0.5 mL/min;檢測波長:240 nm。

2.1.2 樣品處理及溶液制備

取吳茱萸原料，于80 ℃烘箱中干燥2.5 h，粉碎，過篩，索氏提取脫脂2 h，晾干，精密稱取脫脂吳茱萸0.1 g，置250 mL 聚四氟乙烯消化罐中，加入提取溶劑，潤濕40 min，于中藥微波萃取儀中提取，放置室溫，轉移至50 mL 容量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，進樣前用0.45 μm 針頭過濾器過濾，作為供試品溶液。分別精密稱取對照品吳茱萸堿1.9 mg 和吳茱萸次堿1.6 mg，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成質量濃度分別為0.19 g/L和0.16 g/L 的吳茱萸堿對照品溶液和吳茱萸次堿對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗:按擬訂色譜條件進行試驗，結果吳茱萸堿和吳茱萸次堿分離良好，無雜質干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密抽取吳茱萸堿對照品溶液(0.19 g/L)和吳茱萸次堿對照品溶液(0.16 g/L)1，2，4，8，16 μL，按擬訂色譜條件依法進樣，記錄色譜峰。結果吳茱萸堿質量濃度在4.00 ～128.00 μg/mL 之間、吳茱萸次堿質量濃度在4.75 ～152.00 μg/mL與峰面積呈良好線性關系，吳茱萸堿與吳茱萸次堿的回歸方程分別為Y=196 658 X(r=0.999 6);Y=278 868 X，(r=0.999 0)。

精密度試驗:取上述2 種對照品溶液各1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別依法同體積重復進樣5 次。結果吳茱萸堿的RSD 為0.72%，吳茱萸次堿的RSD 為0.85%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密稱取湖南產樣品0.1 g，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h 時進樣，測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積。結果吳茱萸堿的RSD 為1.51%，吳茱萸次堿的RSD 為0.93%，表明供試品溶液在8 h 內穩定。

加樣回收試驗:分別稱取不同產地已知吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的吳茱萸樣品各5 份，依法處理并進樣測定，計算回收率。結果見表2。

2.2 提取溶劑選擇

試驗研究了乙酸乙酯、丙酮、不同濃度的乙醇和甲醇等溶劑對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響，在以微波提取功率400 W、提取時間8 min、溶劑倍數1 ∶200 的條件下。結果以90%乙醇為提取溶劑提取效果最佳。

2.3 提取工藝正交試驗設計

將吳茱萸粉末用索氏提取器提取2 h，取出，干燥，再精密稱取0.1 g 吳茱萸粉末，置250 mL 聚四氟乙烯樣品瓶中，用90%乙醇密封浸潤40 min，在微波萃取儀中進行提取，提取液轉移至50 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，用0.45 μm 針頭過濾器過濾。

表2 吳茱萸堿和吳茱萸次堿加樣回收試驗結果(n=5)

設計L9(34)正交試驗，在用90%乙醇為溶劑的前提下，考察提取功率(因素A)、提取時間(因素B)、料液比(因素C)、顆粒粒徑(因素D)等因素對提取率的影響。正交試驗因素和水平見表3，按正交試驗設計提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿，結果及極差分析見表4，方差分析見表5。

表3 正交試驗的因素水平表

表4 提取工藝正交試驗結果及極差分析

表5 正交試驗方差分析表

極差分析數據表明，對于吳茱萸堿，提取功率為400 W，提取時間為6 min，溶劑倍數為1 ∶100 時，提取率較高，顆粒粒徑對提取率影響不大;對于吳茱萸次堿，提取功率為400 W，提取時間為6 min，溶劑倍數為1 ∶100 時提取率較高，顆粒粒徑對提取率影響不顯著。方差分析結果顯示，溶劑倍數、提取功率、提取時間和顆粒粒徑對吳茱萸堿和吳茱萸次堿影響不大。綜合極差和方差分析，同時考慮到經濟因素，提取吳茱萸堿的最佳條件為A2B3C1D3，提取吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，考慮到粒度對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率影響較小。綜合以上因素，選定提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，即提取功率為400 W，提取時間為6 min，溶劑倍數為1 ∶100，顆粒粒徑為0.150 mm。

2.4 各產地吳茱萸總生物堿含量提取比較

分別取重慶、廣西、青島、北京同仁堂、湖南5 個產地的吳茱萸藥材，按2.3 項下方法操作進行提取，條件為A2B3C1D2，按擬訂色譜條件進樣分析，結果見表6。可見，廣西產吳茱萸提取的吳茱萸生物總堿最多。

表6 吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿穩定性試驗結果

3 討論

在溶劑選取中，分別選用乙酸乙酯、丙酮、5 個不同濃度的乙醇和甲醇作為微波提取溶劑。結果表明，90%乙醇提取率較高，故選取90%乙醇作為提取溶劑;提取時間適當延長，微波提取功率適當增大，對提取率有利，但提取時間過長，提取功率過大，溫度升高過快，溶劑揮發較大，提取率反而降低;樣品粒度對提取率影響較小。綜合以上因素，試驗選定提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的最佳條件為A2B3C1D2，即提取功率為400 W，提取時間為6 min，溶劑倍數為1 ∶100，顆粒粒徑為0.150 mm。試驗結果表明，上述條件比傳統的提取方法有提取時間更短，生物堿的轉移率更高等優點，可用于吳茱萸中吳茱萸生物總堿的提取。

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