大孔吸附樹脂對草魚肽的脫鹽作用

林利美，胡勤玲，王 申，吳永寧,2，宮智勇,*

（1.武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100021）

大孔吸附樹脂對草魚肽的脫鹽作用

林利美1，胡勤玲1，王 申1，吳永寧1,2，宮智勇1,*

（1.武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100021）

目的：研究DA201-C大孔吸附樹脂對草魚肽的脫鹽作用。方法：對脫鹽前后草魚肽的灰分、肽含量、分子質量及氨基酸組成進行分析，采用脫鹽率、血管緊張素轉化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基清除率和鐵還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant potential，FRAP）為指標考察其脫鹽效果。結果：草魚肽的脫鹽率為82.02%，脫鹽處理后，肽片段和疏水氨基酸得到有效富集；ACE抑制活性顯著增大，半抑制質量濃度（IC50）由0.36 mg/mL變為0.23 mg/mL；抗氧化性增強，其IC50由5.59 mg/mL變為4.48 mg/mL；總抗氧化值由1.018增大到1.261。結論：采用DA201-C大孔吸附樹脂對草魚肽脫鹽是一種簡便有效的處理方法。

大孔吸附樹脂；草魚肽；脫鹽

草魚活性肽是利用蛋白質水解草魚肉蛋白得到的一類對生命活動有益的寡肽的統稱，分子質量通常位于200～10 000 D之間[1]。草魚肽易消化吸收，具有良好的熱穩定性、溶解性等理化性質及降血壓、降血脂、抗氧化等生理功能[2-3]。酶解法得到的多肽在安全、口味、營養價值上都要高于堿水解法得到的多肽[4-6]，目前酶解法制取生物活性肽已成為研究的熱點。

由于在酶解草魚肉蛋白的過程中，需要不斷的加入堿液以維持反應體系的pH值恒定，導致草魚肽中殘留了大量的無機鹽，鹽分的存在不僅不利于對草魚肽的深入研究與分析，更影響了其風味和理化性質，因此需要進行脫鹽處理[7]。目前對生物活性物質的脫鹽方法主要有透析、超濾、納濾等。但這些方法對小分子物質脫鹽效果不佳或無法實現。盡管電滲析可以用于小分子物質脫鹽，但回收率不高，能源消耗較大[8]。

大孔吸附樹脂是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的一類新型的非離子型高分子吸附劑，其吸附作用主要是基于化合物的疏水基團與非極性吸附劑之間的范德華力和靜電引力[9]。因其具有選擇性好、吸附容量大、回收率高、再生處理簡單，對脫鹽原料理化性質影響較小等優點，越來越受到研究工作者的青睞。

本實驗利用DA201-C大孔吸附樹脂對草魚肽進行脫鹽處理，重點比較了處理前后草魚肽的灰分含量、肽含量、分子質量、氨基酸組成，對血管緊張素轉化酶的抑制活性以及抗氧化性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚活性肽（蛋白質含量79.26%、肽含量62.07%、水分含量5.69%、灰分含量19.91%） 實驗室自制。

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydratecas，HHL）、馬尿酸（hippuric acid，HA）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團有限公司；乙腈（色譜純） 中國醫藥集團總公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1525-2998 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；iMark 酶標儀 美國Bio-Rad公司；DDS-307型電導率儀上海市精密科學儀器有限公司；HD-3紫外分析儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；7200可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔吸附樹脂對草魚肽的脫鹽[10]

用3.5 cm×50 cm的玻璃層析柱裝滿DA201-C大孔吸附樹脂，室溫下以10 mg/mL的質量濃度上樣吸附，上樣流速為1.5 BV/h，用紫外檢測儀檢測流出液的A220nm，以A220nm為0.05時作為透過點。平衡后用雙蒸水洗滌層析柱，每10 mL一管收集洗脫液并測定其電導率，當電導率值與水一致時，用75%乙醇洗脫樹脂，流速為3 BV/h。收集洗脫峰，旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥后得到脫鹽草魚肽。

1.3.2 肽成分分析

1.3.2.1 灰分含量的測定[11]

采用馬弗爐灰化法，按照GB5009.4—2010《食品中灰分的測定》標準進行。

1.3.2.2 肽含量的測定[12]

按照大豆肽粉行業標準QB/T 2563—2004《大豆肽粉行業標準》進行。

1.3.2.3 分子質量的測定[13]

采用排阻色譜-多角度激光光散射-折光聯用技術測定草魚肽分子質量分布。取樣品0.03 g，用0.9%的NaCl溶解，14 000 r/min離心5 min，取上清液20 ?L進樣。色譜柱：PL aquagel-OH 30（7.5 mm×300 mm）；流動相：0.9% NaCl水溶液；流速：1 mL/min；檢測器：Wyatt反射型示差折光檢測器，波長：664 nm；Varian 335二極管陣列檢測器，波長：230 nm；Wyatt 18角激光散射檢測器，波長：664 nm；計算模式：Zimm 模式（激光轉角）。

1.3.2.4 氨基酸組成分析[14]

將1 g樣品置于水解管中，加入6 mol/L含1%苯酚的鹽酸5 mL。真空充入氮氣，火焰封口。105℃水解24 h，冷卻后過濾，定容。采用高效液相色譜法測定其氨基酸組成。

1.3.3 ACE抑制活性的測定[15-17]

在一定條件下，HHL在體外與ACE反應可生成HA，HA在228 nm波長處有最大吸收，因此HA生成量的大小可反映ACE的活性。本研究利用反相高效液相色譜法檢測草魚肽對ACE的抑制活性。以0.05 mol/L的硼酸鹽緩沖液（含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）為溶劑，配制濃度為2.5 mmol/L的HHL溶液，依次取30 μL HHL、10 μL草魚肽，37℃恒溫水浴5 min后加入ACE 20 μL，恒溫反應1 h，然后加入HCl 70 μL終止反應，得到供試液。

色譜條件：色譜柱：O D S C18分析型色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；二極管陣列檢測器，檢測波長：228 nm；流速：0.8 mL/min；流動相A：水（含0.05%三氟乙酸） ；流動相 B：乙腈（含0.05%三氟乙酸）；進樣量：20 μL；柱溫：25℃；梯度洗脫條件：10%～60% B（15 min）；60%～10% B（3 min）。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定[18]

用雙蒸水溶解樣品并配制一系列梯度質量濃度，以無水乙醇溶解DPPH使其濃度為0.1 mmol/L，取草魚肽和DPPH溶液各2 mL混合均勻，室溫放置30 min后測其吸光度。按照式（3）計算清除率。

式中：Ai為DPPH＋肽液的吸光度；Aj為肽液+無水乙醇的吸光度；A0為DPPH＋無水乙醇的吸光度。

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1.3.5 總抗氧化活力的測定[19]

按照碧云天生物技術研究所生產的總抗氧化能力檢測試劑盒進行檢測。總抗氧化能力以鐵還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant potential，FRAP）即單位樣品的吸光度在標準曲線上相對應的FeSO4濃度的當量表示。FRAP值越大，抗氧化活性越強。

1.4 數據處理

數據采用SPSS17.0 統計分析軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 草魚肽成分分析

表1 脫鹽對草魚肽的灰分、肽含量和分子質量的影響Table 1 Effects of desalination on ash content, peptide content and molecular weight distribution of GCP

以灰分含量、分子質量分布和氨基酸組成為指標對草魚肽脫鹽前后的成分進行分析。由表1可知，經過DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽處理后，草魚肽的灰分含量＜5%，脫鹽率達82.02%，肽含量由62.07%增大到89.35%；分子質量分布較為集中，主要在400～900 D之間。對脫鹽前后草魚肽的氨基酸組成進行分析，結果見表2，經過脫鹽處理，草魚肽中的疏水氨基酸得到了有效的富集，由272.6 mg/g增大到338.2 mg/g，其中Pro、Tyr、Leu等氨基酸殘基含量顯著增大。

表2 脫鹽對草魚肽氨基酸組成的影響Table 2 Effect of desalination on amino acid compositions of GCPTable 2 Effect of desalination on amino acid compositions of GCP mg/g

2.2 草魚肽對ACE的抑制活性

ACE在血壓調節系統中可以把血管緊張素Ⅰ轉化為收縮因子血管緊張素Ⅱ，引起血壓升高，因此可以通過抑制其活性達到降低血壓的目的[20]。表3列出了脫鹽前后不同濃度草魚肽對ACE活性的抑制率，回歸分析得線性方程y=48.875x3－162.66x2＋176.24x＋5.722 7（R2=0.996 4）和y=48.596x3－153.44x2＋159.07x＋18.079（R2=0.997 7），歸一化求解得到脫鹽前后草魚肽對ACE抑制活性的IC50分別為0.36、0.23 mg/mL。

表3 脫鹽對草魚肽ACE抑制活性的影響Table 3 Effect of desalination on ACE inhibitory activity of GCP %

2.3 草魚肽對DPPH自由基的清除作用

表4 脫鹽對草魚肽DPPH自由基清除率的影響Table 4 Effect of desalination on DPPH free radical scavenging Table 4 Effect of desalination on DPPH free radical scavenging capacity of GCP GCP %

由表4可知，隨著草魚肽質量濃度的增大，肽對DPPH自由基清除率逐漸增強，且同一質量濃度條件下，脫鹽后肽的清除率均高于脫鹽前。對數據回歸分析得線性方程y = －0.002x3－0.025 7x2＋7.689 6x＋8.067 5（R2= 0.995 2）和y=－0.001 7x3－0.231x2＋10.083x＋9.890 1（R2=0.998 7），歸一化求解得脫鹽前后草魚肽對DPPH自由基清除率的IC50分別為5.59、4.48 mg/mL。脫鹽后，草魚肽對DPPH自由基清除率顯著增大。

2.4 草魚肽的總抗氧化能力

FRAP法是基于單電子轉移機理通過FRAP值來反應樣品的總抗氧化能力。由圖1可知，經過脫鹽處理，草魚肽的FRAP值由1.018增大到1.261，表明脫鹽處理提高了其總抗氧化能力。

圖1 脫鹽對草魚肽總抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of desalination on FRAP values of GCP

經過脫鹽處理，草魚肽的抗氧化性明顯提高，抗氧化性與肽片段的分子質量、氨基酸組成和結構有關。其分子質量通常在500～1 500 D之間[24]，分子質量適中，其供氫基團才能充分暴露并與自由基反應，表現出強的抗氧化能力。疏水性支鏈氨基酸Val和Leu在N端時肽的抗氧化性增強[25]。Sarmadi等[26]研究表明，Tyr、Trp、Met、Lys、Cys和His是抗氧化肽的特征氨基酸。

3 結 論

大孔吸附樹脂DA201-C對草魚肽具有較好的脫鹽效果，脫鹽率達82.02%，且具有一定的純化作用，小分子肽片段和疏水性氨基酸得到有效富集。經過脫鹽處理，其ACE抑制活性顯著增強，DPPH自由基清除率和總抗氧化性能力明顯增大。利用DA201-C大孔吸附樹脂對草魚肽進行脫鹽是一種簡便有效的處理方法，具有潛在的工業應用前景。

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Desalination of Grass Carp Peptides with Macroporous Adsorption Resin

LIN Li-mei1, HU Qin-ling1, WANG Shen1, WU Yong-ning1,2, GONG Zhi-yong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China)

Objective: To investigate the desalination of grass carp peptides (GCP) with macroporous adsorption resin DA201-C. Methods: Ash and peptide contents, molecular weight and amino acid composition of GCP were analyzed before and after desalination. Desalination efficiency, angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant potential (FRAP) were used to evaluate how well GCP was desalinated. The results showed that the desalination efficiency of GCP was 82.02%. The peptide fragments and hydrophobic amino acids were enriched in desalinated GCP. Meanwhile, the ACE inhibitory activity was significantly higher than that of native GCP, showing a decrease in IC50from 0.36 to 0.23 mg/mL, and the antioxidant activity was also increased showing an IC50of 4.48 mg/mL compared to 5.59 mg/mL for native GCP. The desalination resulted in an increase in the FRAP value of GCP from 1.018 to 1.261. Conclusion: The use of macroporous adsorption resin DA201-C provides a simple and effective method to desalinate GPC.

macroporous adsorption resin; grass carp peptides; desalination

TS254.9

A

1002-6630（2014）05-0033-04

10.7506/spkx1002-6630-201405007

2013-02-26

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2010AA023003）；武漢工業學院校研究生創新基金資助項目（2011cx013）

林利美（1986—），女，碩士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：llm2805810@163.com

*通信作者：宮智勇（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品毒理學。E-mail：gongzycn@yahoo.com