綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學性質

劉 穎，韓春然，張 帥，張瑋瑋，竇博鑫

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學性質

劉 穎，韓春然，張 帥，張瑋瑋，竇博鑫

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

針對綠色木霉AS3.3711產生的β-葡萄糖苷酶組分，先后運用包括乙酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內的一系列分離純化技術對該纖維素酶進行純化，得到β-葡萄糖苷酶純化組分，并對該酶的酶學性質進行研究。純化后酶液的蛋白質量濃度為8.12 mg/mL、酶活力為4.08 U/mL，純化倍數達到18.48，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定分子質量為66.0 kD。綠色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性條件下穩定性良好，最適pH值為5.0；在溫度60～70℃能長時間保持較高酶活力，最適反應溫度為60 ℃。金屬離子中，Ca2+、Mg2+、K+對綠色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促進作用，Ca2+促進作用最強；而Zn2+、Fe3+對該酶有抑制作用，Ag+、Cu2+、Hg2+重金屬離子使β-葡萄糖苷酶幾乎喪失了全部活性。

綠色木霉；β-葡萄糖苷酶；分離純化；酶學性質

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一類糖蛋白總稱。目前認為，至少需要3種功能不同且又互補的纖維素酶協同作用才能完全降解纖維素，即內切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.94）和β-葡萄糖苷酶（纖維二糖酶，EC3.2.1.21）[1-3]。其中β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖，防止纖維二糖的積聚，減輕其對纖維素酶的抑制作用，決定了纖維素糖化過程的最終效率，是促進纖維素降解過程的關鍵酶[4-8]。同時，β-葡萄糖苷酶也能水解其他有重要生理作用的β-葡萄糖苷。有研究發現利用β-葡萄糖苷酶水解白藜蘆醇的糖苷鍵，釋放出游離白藜蘆醇，將葡萄籽中的白藜蘆醇由結合型糖苷轉化為具有生理活性的糖苷[9]。該酶廣泛存在于各種微生物中[10-17]，目前的研究多集中于由真菌、曲霉以及細菌等產生的β-葡萄糖苷酶的制備、純化及酶學性質[17-20]，對綠色木霉（Tridchoderma viride）的研究并不多見[21]。不同來源（即使是同一菌種的不同菌株或同一植物的不同組織）的β-葡萄糖苷酶的分子質量從幾十kD到幾百kD均有報道。已報道的β-葡萄糖苷酶的等電點大多數在酸性范圍，一般在pI 3.5～5.5，但最適pH值可以超過7.0，并且酸堿耐受性強。β-葡萄糖苷酶最適溫度在40～110 ℃均有分布；來自植物的β-葡萄糖苷酶最適溫度在40 ℃左右，而來自古細菌的β-葡萄糖苷酶的熱穩定性和最適溫度要高于普通微生物來源的β-葡萄糖苷酶[1,8]。

液態發酵制得的纖維素酶系是一個動態變化的復合酶體系，不同來源、不同類型纖維素酶系中的β-葡萄糖苷酶糖基化程度、糖鏈聚合度以及糖鏈分支均有差異，表現為分子質量的差別、酶學性質多樣性[22-24]。綠色木霉作為生產纖維素酶的重要菌種，近年來多為內切酶、外切酶的研究，而對纖維素降解同樣起協同作用的β-葡萄糖苷酶研究較少。本實驗利用一株具有較高纖維素酶活性的綠色木霉AS3.3711為出發菌株，AS3.3711液體發酵生產纖維素酶，針對其中的β-葡萄糖苷酶進行了包括硫酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內的一系列分離純化技術，以獲得綠色木霉β-葡萄糖苷酶純化組分，并研究該酶的分子質量以及酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠色木霉（Trichoderma viride）AS3.3711 中國科學院微生物研究所。

水楊苷、過硫酸銨、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 美國Sigma公司；硫酸銨 天津大茂化工公司；考馬斯亮藍 北京鼎國生物技術發展中心；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 上海化學試劑公司；十二烷基硫酸鈉、甘氨酸濟南賽恩斯科技有限公司；Tris、甲硫氨酸 上海伯奧生物科技有限公司；低分子質量標準蛋白Marker 上海東風化學試劑公司。

搖瓶發酵培養基：4.0 g/100 mL麩皮和3.0 g/100 mL玉米粉、0.1 g/100 mL (NH4)2SO4、0.2 g/100 mL KH2PO4、0.1 g/100 mL吐溫-80，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

蛋白質層析系統 上海科學儀器廠；JY5000電泳儀 北京市君意機電技術有限公司；HLQ-C空氣浴振蕩培養箱 天津實驗儀器廠；YXQ-SG46-280手提式壓力消毒器 上海佳騰實驗設備有限公司；PHS-25精密數顯酸度計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-5低速離心機 上海安亭科學儀器廠；722紫外分光光度計上海分析儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

在馬鈴薯斜面固體培養基上30 ℃活化綠色木霉菌種48 h，然后接入馬鈴薯固體培養基中（種子培養基）30 ℃恒溫培養24 h。用無菌水洗下種子培養基中的孢子，接入發酵培養基，按體積分數10%量接種，30 ℃恒溫、180 r/min搖床培養72 h，取發酵液4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化

1.3.2.1 硫酸銨沉淀法初級純化

取適量等體積的粗酶液5組，均緩慢加入硫酸銨至飽和度25.0%，于4 ℃靜置過夜，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液。然后分別向5組離心上清液中加入硫酸銨至飽和度50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%，于4 ℃靜置過夜，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于適量pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液中，測定β-葡萄糖苷酶活力。

1.3.2.2 葡聚糖凝膠柱層析分離純化

對于初級純化后的β-葡萄糖苷酶活力高的組分，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液溶解，進行透析法除鹽處理以降低離子強度，達到完全除鹽效果。收集透析袋中的溶液，于4 ℃保存備用。

將透析后的酶液分別進行葡聚糖凝膠Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150柱層析洗脫，每15 min收集1管樣品，以洗脫峰的分離效果及洗脫峰組分的β-葡萄糖苷酶活性為指標，確定最佳凝膠型號。洗脫參數：層析柱徑高比1.0 cm×100.0 cm；洗脫液為pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液，流速0.2 mL/min，檢測波長280 nm。

1.3.3 SDS-PAGE電泳測定分子質量

12.5 %分離膠，5.0%濃縮膠，100 V恒壓電泳，染色劑遷移至距下端2 cm左右時停止電泳。電泳以經一系列分離純化后的β-葡萄糖苷酶純化組分為上樣品，以低分子質量標準蛋白Marker為標準蛋白，采用考馬斯亮藍R-250染色處理。

1.3.4 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學性質研究

1.3.4.1 最適反應溫度

溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃反應30 min，測定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，分別計算不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶的相對酶活力（即在不同溫度條件下的剩余的酶活力占其中酶活力的最高值的百分比）。

1.3.4.2 最適反應pH值

在濃度為0.2 mol/L、pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液中，60 ℃恒溫反應60 min，測定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，分別計算不同pH值條件下β-葡萄糖苷酶的相對酶活力。

1.3.4.3 熱穩定性

溫度分別為60、65、70、75、80℃時，酶液分別保溫0、10、20、30、40 min后，測定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，考察不同溫度對β-葡萄糖苷酶的相對酶活力的影響。

1.3.4.4 pH值穩定性

酶液分別在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液中，60 ℃恒溫反應2 h，測定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，考察不同pH值環境對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響[25-27]。

1.3.4.5 金屬離子的影響

分別向反應體系中加入終濃度為1.0 mmol/L的NaCl、KCl、AgNO3、MgSO4、CaCl2、CuSO4、BaCl2、MnSO4、ZnSO4、HgCl2、Fe2(SO4)3溶液，于60 ℃恒溫反應30 min，同時以不添加金屬離子為對照組，考察不同金屬離子對于β-葡萄糖苷酶酶活力的影響[28-29]。

1.3.5 分析檢測方法

1.3.5.1 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[30]。

1.3.5.2 β-葡萄糖苷酶的酶活力測定方法

取0.5 mL一定稀釋度的樣液，加入0.5 mL、0.5 g/100 mL的水楊苷（溶于0.1 mol/L、pH 4.8醋酸緩沖液中），55 ℃保溫20 min后，加入1 mL DNS試劑充分混合后，于沸水中滅酶處理5 min，待完全冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL。在520 nm波長處，采用722型分光光度計測定樣品光密度值，以加熱滅活的酶液作為空白組。在上述條件下，定義每小時由底物產生1.0 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（1 U）[29-32]。

2 結果與分析

2.1 綠色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨沉淀法初級純化

表1 硫酸銨沉淀法初級純化β-葡萄糖苷酶的結果Table 1 Preliminary separation of β-glucosidase frroomm Trichodeerrmmaa virriiddee by ammonium sulfate precipitation

經硫酸銨沉淀法初級純化后的β-葡萄糖苷酶活力如表1所示，經飽和度為25.0%的硫酸銨去除部分雜蛋白及菌絲體，4 ℃靜置過夜，離心上清液中的β-葡萄糖苷酶酶活力4 060.68 U/mL，除雜效果較好，同時保持了較強的纖維素酶活力，定義此時的相對酶活力為100.0%；然后向5組離心上清液中分別加入硫酸銨至不同飽和度，再次4 ℃靜置過夜，取各離心沉淀分別于25 mL乙酸鈉緩沖液中充分溶解。從表1可知，硫酸銨飽和度為80.0%及90.0%時，粗酶液的相對酶活力均可達到90.0%以上，分離純化效果顯著，但綜合考慮硫酸銨沉淀法的純化效果、實驗操作性及經濟實用性，選擇80.0%飽和度硫酸銨初步分離純化纖維素酶β-葡萄糖苷酶。

2.1.2 葡聚糖凝膠柱層析分離純化

收集先后經飽和度為25.0%、80.0%的硫酸銨沉淀法初級分離純化后的粗酶液，對其進行充分透析除鹽處理，以除去硫酸銨、大部分色素以及其他蛋白質、多肽、糖類等雜質。準確量取1.0 mL經透析后的酶液，分別加樣于具有不同交聯度的葡聚糖凝膠Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150層析柱進行洗脫實驗，分離純化結果如圖1～3所示。

圖1 Sephadex G-75凝膠柱層析純化圖譜Fig.1 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-75 gel column chromatography

圖2 Sephadex G-100凝膠柱層析純化圖譜Fig.2 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-100 gel column gel column chromatography

圖3 Sephadex G-150凝膠柱層析純化圖譜Fig.3 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-150 gel column chromatography

酶液經Sephadex G-75柱層析純化后只得到一個洗脫峰A，分離效果不理想；經過Sephadex G-100柱層析純化后，可以得到2個洗脫峰A’和B’，但洗脫峰B’的峰面積及分離度均較小；酶液經過Sephadex G-150分離純化后共得到2個洗脫峰Ⅰ和Ⅱ，峰面積及峰型均最好，故選擇葡聚糖凝膠Sephadex G-150柱層析分離純化β-葡萄糖苷酶。通過測定2個主峰的β-葡萄糖苷酶酶活力可知洗脫峰Ⅰ具有酶活力，達到4.08 U/mL，收集洗脫組分峰Ⅰ物質。

2.1.3 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化過程分析

表2 分離純化綠色木霉β-葡萄糖苷酶效果Table 2 Summary of purification of β-glucosidase from Trichoderma viride

綠色木霉發酵上清液先后經過硫酸銨沉淀、葡聚糖凝膠柱層析色譜純化，獲得綠色木霉β-葡萄糖苷酶的純化物，該分離純化過程如表2所示，純化倍數達到18.48倍。

2.2 SDS-PAGE電泳測定蛋白質分子質量

圖4 綠色木霉β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of β-glucosidase from Trichoderma viride

采用SDS-PAGE凝膠電泳法測定分離純化得到的β-葡萄糖苷酶純化峰Ⅰ組分的分子質量，結果如圖4所示。峰Ⅰ組分可得到兩條清晰的譜帶a和b。其中譜帶a代表分子質量約為66.0 kD的蛋白組分，譜帶b代表分子質量為40.0 kD。由于不同來源的酶在酶學性質上有較大差異，結合文獻報道的纖維素酶的種類和相對分子質量，譜帶a中含有純化出的綠色木霉β-葡萄糖苷酶的可能性較大[10,21,27-28]，而譜帶b與和內切葡聚糖酶的分子質量較為相近[4-5,33]，需要進一步確定其組分。

2.3 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學性質

2.3.1 最適反應溫度

如圖5所示，綠色木霉產生的β-葡萄糖苷酶在溫度20～60 ℃時，其相對酶活力顯著上升（P＜0.05）；而溫度60～70 ℃時，相對酶活力顯著下降（P＜0.05），確定綠色木霉β-葡萄糖苷酶最適反應溫度為60 ℃。

圖5 溫度對綠色木霉產生的β-葡萄糖苷酶的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

2.3.2 最適反應pH值

圖6 pH值對綠色木霉產生的β-葡萄糖苷酶的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

在pH 3.0～8.0的緩沖液中保溫，β-葡萄糖苷酶的活力測定結果如圖6所示。在pH 3.0～4.0時，相對酶活力顯著上升（P＜0.05）；pH 4.0～5.0時，相對酶活力呈平緩上升趨勢（P＞0.05）；而pH 5.0～8.0時，相對酶活力顯著下降（P＜0.05），下降幅度達到64.34%，確定綠色木霉β-葡萄糖苷酶最適反應pH值為5.0。

2.3.3 熱穩定性

圖7 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of β-glucosidase from Trichoderma viride

由圖7可知，β-葡萄糖苷酶在60 ℃時，其酶活力在30 min內幾乎保持不變；在65 ℃時，其相對酶活力也比較穩定；而當溫度升至70 ℃時，β-葡萄糖苷酶半衰期為30 min；溫度繼續上升為80 ℃時，其半衰期為20 min，仍具有18.23%相對酶活力。綠色木霉β-葡萄糖苷酶具有較好的耐熱穩定性。

2.3.4 pH值穩定性

圖8 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的pH值穩定性Fig.8 pH stability of β-glucosidase from Trichoderma viride

于不同pH值環境中保溫處理2 h后測定β-葡萄糖苷酶的活性，結果如圖8所示。綠色木霉β-葡萄糖苷酶在pH 3.0～6.0酸性條件下，相對酶活力均可保持60.0%以上；而在中性pH 7.0及堿性環境中，酶活力降低，但仍保持21.03%相對酶活力。綠色木霉β-葡萄糖苷酶耐酸堿穩定性良好。

2.3.5 金屬離子對酶活性的影響

圖9 金屬離子對綠色木霉β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.9 Effects of different metal ions on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

由圖9可知，不同金屬離子對該β-葡萄糖苷酶的活力影響差異十分顯著，Ca2+對該酶的激活促進作用最強[28-29]，同時Mg2+、K+對β-葡萄糖苷酶活力也起促進作用；Zn2+、Fe3+對該β-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制作用，但酶仍具有活性；而重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+對β-葡萄糖苷酶抑制作用明顯，使其酶活性幾乎全部喪失。

3 結 論

本實驗先后運用包括硫酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內的一系列純化技術，對綠色木霉AS3.3711產生的β-葡萄糖苷酶組分進行了分離與純化，采用SDS-PAGE電泳測定了酶蛋白組分的分子質量范圍，并研究其酶學性質。相關結論如下：

先后采用飽和度分別為25.0%和80.0%的硫酸銨初級純化含有β-葡萄糖苷酶的粗酶液，經飽和度25.0%的硫酸銨純化后的酶活力為11.35 U/mL；經飽和度80.0%的硫酸銨純化后的酶活力為10.25 U/mL，相對酶活力達到90.0%，分離純化效果顯著，且酶活力損失較小。

經充分透析除離子及雜質后，采用Sephadex G-150分離純化經綠色木霉液態發酵產生的β-葡萄糖苷酶，可得到2個洗脫峰，其中組分峰Ⅰ具有β-葡萄糖苷酶酶活力，其蛋白總含量為8.12 mg/mL，酶活力4.08 U/mL，比活力0.573 U/mg，純化倍數達到18.48倍。經SDS-PAGE電泳測定洗脫組分Ⅰ分子質量為66.0 kD。

綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學性質：最適pH值為5.0，最適反應溫度60 ℃；在酸性條件下有較強穩定性，耐酸堿性良好；溫度60～70 ℃時，能長時間保持較高酶活力，熱穩定性良好；離子濃度為1.0 mmol/L時，Ca2+、Mg2+、K+對β-葡萄糖苷酶活力起促進作用，其中Ca2+促進作用最強，Zn2+、Fe3+對該酶有不同程度的抑制作用，重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+幾乎使β-葡萄糖苷酶喪失全部活性。

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Separation, Purification and Enzymatic Properties of β-Glucosidase from Tridchoderma viride

LIU Ying, HAN Chun-ran, ZHANG Shuai, ZHANG Wei-wei, DOU Bo-xin
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

An extracellular β-glucosidase produced by Trichoderma viride AS3.3711 was separated and purified by ammonium acetate precipitation, dialysis and Sephadex G-150 column chromatography. The results of enzyme characterization showed that the protein concentration of the purified enzyme solution was 8.12 mg/mL, and the β-glucosidase activity was 4.08 U/mL, with a purification factor of 18.48. Its molecular weight was 66.0 kD. The β-glucosidase from Trichoderma viride displayed a strong stability under acidic conditions and its optimum pH value was 5.0. In the range of 60–70 ℃, it could still maintain a high enzyme activity for a long time with an optimum reaction temperature of 60 ℃. Some metal ions including Ca2+, Mg2+and K+improved its activity with Ca2+having the strongest effect. However, Zn2+and Fe3+inhibited the enzyme. Heavy metal ions such as Ag+, Cu2+and Hg2+almost totally inactivated its activity.

Tridchoderma viride; β-glucosidase; separation and purification; enzymatic properties

Q815；Q814；Q55

A

1002-6630（2014）05-0150-06

10.7506/spkx1002-6630-201405030

2013-03-30

黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目（2010td04）；黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目（160135）；

黑龍江省自然科學基金項目（D01-24）

劉穎（1968—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：dbx0803@163.com