優良降酸酵母菌的篩選及發酵性能

仇小妹，王 英，董明盛，周劍忠,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

優良降酸酵母菌的篩選及發酵性能

仇小妹1,2，王 英1，董明盛2，周劍忠1,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

以能夠降解L-蘋果酸的釀酒酵母FM-cs-08為出發菌株，分別進行紫外誘變和60Co誘變，旨在誘變得到降酸能力顯著提高又具有良好發酵性能的釀酒酵母菌。最終篩選得到誘變菌株FM-cs-08-2U，降L-蘋果酸比率達到（29.48±0.21）%，比出發菌株提高了（25.44±0.89）%。對誘變菌株FM-cs-08-2U的耐受性及發酵特性進行研究，結果表明該菌株耐受最低pH值為2.5，耐受最高SO2質量濃度為800 mg/L。用FM-cs-08-2U發酵藍莓果酒，得到果酒殘糖量（3.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機酸含量（8.64±0.02）g/L，酒精度（12.00±1.00）%，結果證明菌株FM-cs-08-2U適合釀造藍莓果酒。

降酸酵母；誘變育種；發酵性能

L-蘋果酸又名L-2-羥基丁二酸，主要存在于蘋果、葡萄和不成熟的山楂等果實中[1]。蘋果酸含量高會使葡萄酒有酸澀感，酒味粗硬，如何降解果酒中的蘋果酸一直是果酒釀造中一個亟待解決的問題[2-3]。目前果酒的降酸方法主要有物理降酸法、化學降酸法和生物降酸法，但物理降酸法和化學降酸法對果酒的風味物質影響較大，使口感變差，降低果酒的營養價值，其弊端在生產上日益受到重視。要降低酒中蘋果酸含量，宜采用生物降酸法[4]。

果酒生物降解蘋果酸的途徑主要有兩個，其中蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）途徑主要采用乳酸菌將葡萄酒中的蘋果酸轉化為乳酸，其特點是降酸時有選擇性。迄今為止，國外生產的優質紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒大部分采用MLF降酸。而蘋果酸-酒精發酵（malo-alcoholic fermentation，MAF）途徑是通過裂殖酵母利用糖作底物生成酒精外，還能在厭氧條件下分解蘋果酸，最終生成乙醇和CO2。裂殖酵母發酵能力較弱，且會產生不良氣味[4-6]。

本研究以降L-蘋果酸的釀酒酵母菌株FM-cs-08為出發菌，經過紫外誘變和60Co誘變得到降酸效果顯著提高的誘變菌株FM-cs-08-2U，對其耐受性和發酵性能作初步探究，證明誘變菌株能降低果酒酸度的同時保持了良好的發酵能力。此研究為提高果酒品質提供參考，并豐富釀造果酒菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降酸酵母FM-cs-08 本實驗室保藏[7]；兔眼藍莓（含水量（89.50±0.67）%，果實直徑（1.34±0.08）cm，質量（0.98±0.03）g/個，－20 ℃冷藏） 江蘇溧水藍莓種植基地。

葡萄糖、檸檬酸、偏重亞硫酸鈉、氯化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀（均為分析純） 廣東汕頭西隴化工股份有限公司；甲醇（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；L-蘋果酸（分析純） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；酚酞（分析純）、蒽酮（分析純） 上海浦口化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-150生化培養箱 上海恒科技有限公司；THZ-C-1臺式冷凍恒溫震蕩機 太倉市實驗設備廠；SevenEasy plus pH儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16C 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；超級水浴鍋 常州國華電器有限公司；LC2030型高效液相色譜儀 北京安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FM-cs-08生長曲線測定

以2%接種量將活化的FM-cs-08菌株接種到20 mL PDA液體培養基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養。每隔3 h進行取樣，測定OD600nm。

1.3.2 降酸酵母的誘變

將甘油保藏的菌株FM-cs-08轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）液體培養基中，28 ℃、150 r/min搖床培養48 h。以2%接種量將菌液接種到20 mL的PDA溶液中，28 ℃、150 r/min搖床培養。每隔3 h測定菌液的OD600nm，以生理鹽水做空白對照。取對數期菌液，8 000 r/min離心5～10 min獲得菌體，用生理鹽水洗滌兩次，制成菌懸液，待誘變用。

紫外誘變：分別加入5 mL菌懸液于平板上，紫外燈打開預熱30 min，然后在20 W紫外燈，距離20 cm，分別照射0、1、2、3、4、5 min；將照射后的菌液轉移到空試管中，空試管需用鉑紙裹住，0 ℃放置2 h；將照射0 min的對照菌液和經紫外照射的菌液稀釋、涂布于固體PDA上，用黑布包起來，放置在28 ℃培養48 h，計數，計算致死率。

輻照誘變：在南京輻射中心進行輻照誘變。取適量孢子懸液，調整孢子濃度為107個/mL，輻照誘變劑量為0、200、400、600 Gy。經過60Co射線處理后的單孢子懸液稀釋、涂布于固體PDA固體培養基上，以未經60Co誘變處理的菌懸液作為空白對照，于28 ℃培養箱中倒置培養48 h，計數，計算致死率。

1.3.3 降L-蘋果酸菌株的篩選

樣品預篩選及色譜條件選擇：根據致死率挑取形態不同的菌落進行液體培養24 h，按4%接種量將孢子液接種到添加了4 g/L L-蘋果酸的PDA培養基中，28 ℃、150 r/min，培養48 h后，8 000 r/min離心10 min后取上清，經0.22 μm膜過濾后進行反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定。

液相色譜條件[8]：色譜柱：Agilem 20RBAX.SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：3%甲醇-97% KH2PO4緩沖溶液（0.01 mol/L）；流速：0.8 mL/min；進樣體積20 μL；檢測波長：214 nm；柱溫：常溫。

L-蘋果酸標準曲線繪制及L-蘋果酸定性定量測定：用純度＞99%的L-蘋果酸標準品分別配制1、2、3、4、5、6 mg/mL L-蘋果酸標準溶液。0.22 μm膜過濾后，采用RP-HPLC分析，L-蘋果酸的吸收峰在（3.016±0.008）min出現，其峰面積為樣品中L-蘋果酸的含量，可以用于實驗結果比較。

1.3.4 菌株耐受性實驗

1.3.4.1 耐酸能力實驗

配制5瓶20 mL PDA液體培養基，用檸檬酸調節pH值分別為1.5、2.0、2.5、3.0，最后一瓶不做處理。將活化好的誘變菌株FM-cs-08-2U菌液，按2%的量接種于20 mL PDA液體培養基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養。每隔3 h取樣，以無菌生理鹽水做空白對照，測定菌液的OD600nm值。以自然pH值的PDA液體培養液中的菌株生長曲線為對照組，根據曲線判斷菌株耐酸能力。

1.3.4.2 耐SO2能力實驗

配制5瓶20 mL PDA液體培養基，用偏重亞硫酸鈉調節SO2分別為500、600、700、800、900 mg/L。將活化好的誘變菌株FM-cs-08-2U菌液，按2%的量接種于20 mL PDA液體培養基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養。每隔3 h取樣，以無菌生理鹽水做空白對照，測定菌液的OD600nm值。以不添加SO2的PDA液體培養液中的菌株生長曲線為對照組，根據曲線判斷菌株耐SO2能力。

1.3.5 誘變菌株發酵特性研究

按照以下工藝制備4瓶200 mL發酵液置于500 mL三角瓶中：藍莓→打漿→酶解（0.3%果膠酶和0.3%復合果漿酶，40 ℃，4 h）→離心→過濾→添加16%白砂糖、0.01%偏重亞硫酸鈉→分別接種5%干酵母活化菌液及誘變菌FM-cs-08-2U菌液→20 ℃發酵至殘糖量低于4 g/L，即發酵完全。

發酵過程中取樣測定發酵液的總酸、總糖及pH值，觀察其變化。總糖含量測定：蒽酮-硫酸法[9]；總酸：GB/T 15038—1994《葡萄酒、果酒通用試驗方法》中的電位滴定法，以檸檬酸計；酒精度：GB/T15038—1994中的蒸餾比重法[10]；pH值：酸度計。發酵完全后對發酵酒作感官評價。

1.3.6 致死率及降酸率的計算

1.3.6.1 致死率

式中：A1為未經處理的菌株稀釋涂布的菌落數/（CFU/mL）；A2為誘變處理的菌株稀釋涂布的菌落數/（CFU/mL）。

1.3.6.2 降酸率

以L-蘋果酸的不同質量濃度為橫坐標，外標峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，可得到回歸方程y＝90 867x＋101 182（R2=0.999 9）。

式中：ρ0為空白對照中L-蘋果酸質量濃度/（g/L）；ρi為不同處理樣中L-蘋果酸質量濃度/（g/L）。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 FM-cs-08生長曲線及不同誘變方法對FM-cs-08致死率的影響

2.1.1 FM-cs-08生長曲線

圖1 酵母菌FM-cs-08生長曲線Fig.1 The growth cruve of the parent strain FM-cs-08

由圖1可知，3～6 h菌體處于適應期，生長速度較慢；6～12 h，FM-cs-08生長迅速，此時菌株生長達到對數期對誘變比較敏感，因此一般選擇培養了8～9 h的菌體，進行誘變處理。

2.1.2 紫外誘變對FM-cs-08致死率的影響

由靶子學說可知，紫外線在誘變作用之初，菌株數目很大，而此時的輻射劑量很少，輻射作用呈單擊現象，這時紫外光照射作用的效率很高。隨著照射時間延長，存活的菌株逐漸減少，變異菌株逐漸增加，突變率增大；一般紫外致死率在80%～90%，可保證菌體發生最大程度的突變[11-12]。由圖2可知，0～4 min菌株的致死率直線上升，在2 min時致死率達到（80.30±1.75）%，4 min時致死率達到（95.20±1.30）%，5 min之后菌株的致死率基本達到（99.86±0.23）%。所以誘變時間在2～3 min的誘變菌株突變率較高，選擇此時間段的誘變菌液進行稀釋涂布，進而篩選出正突變株。

圖2 紫外誘變致死率曲線Fig. 2 Fatality rate of yeast treated with UV irradiation

2.1.360Co誘變對FM-cs-08致死率的影響

圖3 36060Co誘變致死率曲線Fig.3 Fatality rate of yeast treated with60Co γ-ray irradiation

FM-cs-08對于60Co的敏感性較高，隨著誘變劑量的提高誘變菌的致死率不斷提高。如圖3所示，在誘變的3種劑量中600 Gy劑量條件下的致死率最高。在不超過90%的情況下，菌株的突變率最高，相對應的正突變的數量也最多[13]。所以本實驗采用600 Gy劑量條件下誘變的菌株為篩選的對象。

表1 出發菌與誘變菌降解L-蘋果酸效率Table 1 Degradation efficiencies of the parent strain and the mutant strain ffoorr L-malic aacciidd

由表1可知，空白對照中L-蘋果酸質量濃度為（4.85±0.01）g/L，FM-cs-08發酵液中L-蘋果酸質量濃度為（3.71±0.12）g/L，與空白對照相比，其L-蘋果酸含量降低了（23.50±2.47）%。

從200株經過紫外誘變和60Co誘變的菌株中篩選出1株降酸效果最為顯著的正突變株FM-cs-08-2U，L-蘋果酸的質量濃度為（3.42±0.01）g/L，與空白對照組比較其L-蘋果酸質量濃度降低了（29.48±0.21）%。

2.3 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐受性實驗

2.3.1 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐酸度實驗

圖4 FM-cs-08-2U在不同pH值條件下生長曲線Fig.4 Growth curves of FM-cs-08-2U at different pH values

pH值能夠改變營養物質的電離程度，從而影響細胞對營養物質的吸收，最終影響菌體的生長[14]。 由圖4可知，與對照相比，pH 3環境中生長曲線最為接近，pH 2.5環境中生長曲線明顯出現滯后現象，生長變得緩慢，而pH 2.0與pH 1.5這兩條曲線基本維持水平，說明酵母在此pH值條件下無法正常生長。最終得出該酵母最大耐受酵母pH值為2.5。

2.3.2 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐SO2實驗

在果酒生產中SO2的作用為殺菌、澄清、抗氧化、增酸、改善口味等。適當添加SO2有利于保持果汁的新鮮度，防止微生物的破壞和過早褐變；而添加過多，會抑制酵母活性，影響主發酵；添加過少，則達不到抑制有害微生物生長的作用，使得酒體發酸有異味[15]。

圖5 FM-cs-08-2U在不同SSOO2質量濃度條件下生長曲線Fig.5 Growth curves of FM-cs-08-2U at different concentrations of SO2

誘變菌株FM-cs-08-2U的耐SO2質量濃度實驗結果如圖5所示。與對照生長曲線相比，SO2添加量為500 mg/L和600 mg/L時，菌株生長趨勢跟對照樣基本保持一致，15 h后才進入穩定期；SO2添加量為700 mg/L與800 mg/L時，該酵母生長雖然緩慢，但仍有生長趨勢；添加量為900 mg/L時，菌種生長受到抑制，難以生長，該菌株最大耐SO2質量濃度為800 mg/L。

時和珅用事，世銘憂憤，與同官論前代輔臣賢否，語饑切無所避。會遷御史，則大喜，夜起彷徨，草疏將劾之，詔仍留軍機處。故事，御史留直者，儀注仍視郎官，不得專達封事。世銘自言愧負此官，阿桂慰之曰：“報稱有日，何必急以言自見。”蓋留直阿桂所請，隱全之，使有待。[9]5330

2.4 誘變菌株FM-cs-08-2U的發酵性能研究

2.4.1 誘變菌株FM-cs-08-2U發酵藍莓酒過程中總糖變化

圖6 FM-cs-08-2U藍莓酒發酵過程中殘糖量變化Fig.6 Variation in residual sugar content during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

FM-cs-08-2U發酵藍莓果酒，降糖速度如圖6所示，第1周，殘糖含量迅速下降；從第2周開始降糖速度下降，趨勢較為平緩；經過3周將殘糖含量降至（3.70±0.10）g/L，發酵成干酒。

2.4.2 誘變菌株FM-cs-08-2U發酵藍莓酒過程中總酸變化

圖7 FM-cs-08-2U藍莓酒發酵過程中總酸含量變化Fig.7 Variation in total acid content during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

藍莓汁中主要的有機酸為檸檬酸、蘋果酸，發酵過程中酵母的代謝活動改變了發酵液中有機酸組分的組成和含量[16]，總酸變化趨勢如圖7所示。發酵過程中總酸含量呈先上升后下降的趨勢，在發酵前期，酵母代謝產生有機酸，總酸含量增加；發酵后期，酵母菌的酒精發酵作用將有機酸降解為酒精等小分子物質，使得總酸含量下降[17]。FM-cs-08-2U在發酵前期，代謝旺盛，總酸含量上升較快，從發酵第5天，發酵液中總酸含量開始迅速下降。降酸酵母表現出一定的降酸能力。

2.4.3 誘變菌株FM-cs-08-2U發酵藍莓酒過程中pH值變化

由于發酵液中有機酸組成發生變化，pH值也會發生一定的變化，由圖8可知，發酵過程中pH值變化不穩定，但整體呈上升趨勢。發酵結束時酵母FM-cs-08-2U釀造的藍莓干酒pH值為3.18±0.01。

圖8 8FM-cs-08-2U藍莓酒發酵過程中ppHH值變化Fig.8 Variation in pH during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

2.5 誘變菌株FM-cs-08-2U釀造藍莓酒的理化指標及感官品評

用FM-cs-08-2U發酵藍莓果酒得到的果酒測定理化指標，殘糖量（以葡萄糖計）為（3.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機酸（以檸檬酸計）含量為（8.64±0.02）g/L，酒精度為（12.00±1.00）%；感官指標：外觀深紅，澄清透亮，無懸浮物和沉淀物；具有果香、甜香及典型的酒香；口味協調，酸甜適口，后味較長。

3 結 論

與葡萄酒釀造相關的酵母菌共有18個屬，70多個種，其中部分酵母菌株具有降解蘋果酸的能力。最為典型的是，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）通過蘋果酸-酒精發酵MLF能將蘋果酸分解為酒精和CO2，從而達到降酸的目的[18]。

本實驗通過對降酸釀酒酵母FM-cs-08進行60Co誘變，獲得1株誘變菌株FM-cs-08-2U，降L-蘋果酸比率達到（29.48±0.21）%，比出發菌株提高了（25.44±0.89）%；耐受最低pH值為2.5，耐受最高SO2質量濃度為800 mg/L，同時具有良好的發酵性能。用FM-cs-08-2U發酵藍莓果酒，得到的果酒殘糖量為（3.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機酸含量為（8.64±0.02）g/L，酒精度為（12.00±1.00）%，外觀深紅，澄清透明，具有典型的酒香，口味協調，酸感降低，無苦澀和異味，穩定性好，證明FM-cs-08-2U適合釀造藍莓果酒。與Dharmadhikari等[19]用粟酒裂殖酵母中的G13-3株系發酵葡萄酒相比，FM-cs-08-2U降低了果酒pH值，可使含蘋果酸高的葡萄酒的酸度降低，同樣發酵的果酒沒有明顯的異味產生。在新西蘭，目前已廣泛采用酵母菌株Lalvin-D432和Lalvin-71B進行葡萄酒降酸[20]。本實驗在已有的研究基礎上，對降酸酵母進行誘變育種，并對誘變菌株耐受性及發酵性能進行了探討，豐富了釀酒酵母菌種資源。

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Strain Improvement of Saccharomyces cerevisiae for Acid Degradation and Fermentation Performance of the Screened Strain

QIU Xiao-mei1,2, WANG Ying1, DONG Ming-sheng2, ZHOU Jian-zhong1,*
(1. The Research Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Sac charomyces cerevisiae FM-cs-08, a strain with the ability to degrade L-malic acid, was treated with UV or60Co γ ray irradiation with the aim to obtain a mutant strain having improved acid-degrading ability and fermentation performance. The mutant strain was named FM-cs-08-2U, by which the degradation efficiency of L-malic acid was (29.48±0.21)%, showing a (25.44±0.89)% increase compared with the starting strain. The tolerance and fermentation performance of the mutant strain were assessed and the results showed that its lowest tolerable pH was 2.5 and its highest tolerable SO2concentration was 800 mg/L. The residual sugar content of blueberry wine fermented with FM-cs-08-2U was (3.70 ± 0.10) g/L, pH 3.18±0.01, organic acid content (8.64±0.02) g/L, and alcohol content (12.00±1.00)%. These results indicate that the selected mutant strain is suitable for brewing blueberry wine.

acid-degrading yeast; mutation breeding; fermentation performance

Q815

A

1002-6630（2014）05-0160-05

10.7506/spkx1002-6630-201405032

2013-04-02

江蘇省農業科技自主創新項目（cx（11）2066）

仇小妹（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：qiuxiaomei.789@163.com

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zjzluck@yahoo.com