苦瓜提取物抑制3T3-L1脂肪細胞脂肪沉積研究

屈 瑋，陳彥光，吳祖強，王 鑫

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

苦瓜提取物抑制3T3-L1脂肪細胞脂肪沉積研究

屈 瑋，陳彥光，吳祖強，王 鑫

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

研究表明苦瓜具有一定減肥效果，但其確切分子機理尚未闡明，因此本實驗研究苦瓜正丁醇提取物抑制脂肪沉積活性及其作用機制。針對3T3-L1脂肪細胞，利用噻唑藍法檢測苦瓜正丁醇提取物對細胞活性影響；采用油紅O染色檢測苦瓜正丁醇提取物對細胞脂肪沉積的影響；利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測苦瓜提取物對脂肪沉積轉錄因子和脂肪酸代謝關鍵基因mRNA轉錄水平調控作用。結果表明：相對空白對照組，苦瓜提取物能明顯減少3T3-L1細胞脂肪沉積，抑制轉錄因子C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表達，對脂肪酸代謝基因GLUT4、ACC1、Fasn、AP2和LPL的mRNA表達抑制明顯（P＜0.05）。總之，苦瓜正丁醇提取物對脂肪沉積具有一定抑制作用，可能通過下調脂肪沉積相關基因mRNA轉錄水平表達起作用。

苦瓜；脂肪沉積；3T3-L1細胞

肥胖作為一種代謝疾病已成為危害全球公眾健康的主要問題之一，它與高血壓、二型糖尿病、冠心病和中風等多種疾病的發生密切相關[1]。治療肥胖的藥物主要有西布曲明（Sibutramine）和奧利司他（Orlistat），上述兩種藥物均具有毒副作用，其中西布曲明可能增加服用者患嚴重心血管疾病的風險，其制劑和原料藥已經停止生產和銷售[2]。因此，尋求安全有效的抑制或延緩肥胖發生、發展的天然產物，對解決肥胖防治問題具有十分重要的意義。

脂肪沉積被認為是肥胖發展的關鍵步驟，控制這一步驟將能夠有效地控制肥胖的進程[2]。脂肪沉積包括脂肪組織中脂肪細胞的增殖和前脂肪細胞分化，其中單個脂肪細胞的體積及其分化程度與細胞內甘油三酯積累量密切相關。脂肪的過度沉積是肥胖病理生理過程的核心[3]。3T3-L1脂肪細胞是當前國際上研究脂肪沉積分子機制的重要模型。前脂肪細胞3T3-L1來源于17～19 d Swiss 3T3小鼠胚胎成纖維細胞，經克隆擴增而成，在體外誘導后可分化為成熟的脂肪細胞，是目前國際上公認的研究脂肪沉積過程的細胞株，廣泛用于天然產物抗肥胖活性研究[4]。

苦瓜（Momordica charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬植物，是一種廣為種植的常用蔬菜，富含三萜類化合物、甾體、生物堿、多酚等多類活性次生代謝產物[5]。已有研究表明苦瓜具有減肥作用，苦瓜能夠有效抑制高脂飲食小鼠體質量的增加[6]；減少體內脂肪組織的質量和甘油三酯含量[7]；改善肥胖引起的胰島素抵抗[8-9]；苦瓜提取物能夠抑制肥胖大鼠內臟脂肪聚積和附睪脂肪細胞肥大起到減肥作用[10-11]；苦瓜還可以降低肥胖小鼠脂肪組織中巨噬細胞和肥大細胞的募集，減少脂肪組織分泌炎性因子，從而降低脂肪 組織和系統炎性[12-13]。苦瓜提取物可以抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖、降低脂肪細胞中甘油三酯含量[14]，但是苦瓜抑制脂肪沉積作用機理尚需進一步確認和完善。因此，本研究利用苦瓜的提取物，研究其對3T3-L1細胞脂肪沉積相關基因的調控作用，為基于苦瓜的抗肥胖功能食品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦瓜購買于合肥周谷堆蔬菜批發市場，樣本經安徽大學資源與環境工程學院周忠澤教授鑒定；小鼠3T3-L1前脂肪細胞株來源于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養基、四甲基偶氮唑藍 美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；C/EBPα、PPARγ、SREBP-1c、GLUT4、ACC1、Fasn、AP2、LPL和β-actin引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑為分析純。

Forma 3111 CO2細胞培養箱 美國熱電公司；MyiQ2 Real-time PCR儀 美國伯樂公司；TS100-F倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 苦瓜提取物制備

將苦瓜冷凍干燥后粉碎，使用乙醇萃取3次，合并乙醇提取液，然后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，將正丁醇相旋轉蒸發，得到苦瓜正丁醇提取物[8]。

1.2.2 3T3-L前脂肪細胞培養

將3T3-L1前脂肪細胞置于含10%體積分數胎牛血清的DMEM高糖培養基（25 mmol/L）中，37℃、體積分數5% CO2飽和濕度，1%雙抗（80 U/mL青霉素，0.08 mg/mL鏈霉素）條件培養，長滿80%時傳代，選取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 細胞活力檢測

采用噻唑藍法測定細胞活力。取3T3-L1前脂肪細胞按照5×103個/mL接種于96孔板，100 ?L/孔，培養12 h后分別加入不同質量濃度的苦瓜提取物溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL），連續培養48 h后加入20 ?L 5 mg/mL的噻唑藍培養液，培養4 h后將培養液吸干，每孔加入200 ?L二甲基亞砜，振蕩10 min溶解紫色結晶，然后用酶標儀在550 nm波長處測定光密度值（以650 nm為參考波長）[15]。

1.2.4 苦瓜提取物對3T3-Ll前脂肪細胞分化的影響

將3T3-L1前脂肪細胞接種于24孔板，使用DMEM高糖培養基（含10%體積分數胎牛血清）培養，當細胞完全融合后，加入胰島素分化誘導劑（10 ?g/mL胰島素、0.5 mol/L 3-異丁基1-甲基黃磦呤和1 μmol/L 地塞米松）誘導48 h；然后更換DMEM高糖培養液（含10 ?g/mL胰島素）培養48 h；隨后用DMEM高糖培養基繼續培養2次，每次48 h。自誘導開始，實驗組加入不同質量濃度（0.2、0.4 mg/mL）苦瓜提取物。最后1 d將細胞使用4 g/100 mL多聚甲醛固定后，使用油紅O染色觀察胞漿中脂肪的聚集，染色后觀察拍照；并用無水乙醇洗出油紅O，于脫色搖床搖晃5 min。每孔吸出后加入96孔板中，用酶標儀在510 nm波長處測定光密度值，計算分化后脂肪細胞甘油三酯相對含量[14]。

1.2.5 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）

收集不同質量濃度苦瓜提取物處理8d后的3T3-L1細胞，使用RNAiso Plus試劑盒提取其總RNA，合成第一鏈cDNA，然后取合成產物進行RT-PCR實驗。使用β-actin作為內參基因，利用比較Ct法分析基因表達，選取空白對照組表達量為1，相對表達量表示為其余喂養條件下表達量與其比值百分比。3T3-L1細胞測定基因包括：C/EBPα基因，上下游引物分別是：5’-CAAGAACAGCAACGAGTACCG-3’和5’-G T C AC T G G T C A AC T C C AG C AC-3’；PPARγ基因：5’-GCATGGTGCCTTCGCTGA-3’和5’-TGGCATCTCTGTGTCAACCATG-3’；SREBP-1c基因：5’-GGAGCCATGGATTGCACATT-3’和5’-GGCCCGGGAAGTCACTGT-3’；GLUT4基因：5’-GTGACTGGAACACTGGTCCTA-3’和5’-C C AG C C AC G T T G C AT T G TAG-3’；A C C 1基因：5’-ATCCAGGCCATGTTGAGACG-3’和5’-AGATGTGCTGGGTCATGTGG-3’；Fasn基因：5’-GCTGGCATTCGTGATGGAGTCGT-3’和5’-AGGCCACCAGTGATGATGTAACTCT-3’；AP2基因：5’-AAGGTGAAGAGCATCATAACCT-3’和5’-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3’；LPL基因：5’-TGTGTCTTCAGGGGTCCTTAG-3’和5’-GGGAGTTTGGCTCCAGAGTTT-3’。β-actin基因上下游引物分別是5’-GACATGGAGAAAATCTGGCA-3’和5’-AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。

1.3 數據分析

每個實驗重復3次。采用統計軟件SPSS 16.0分析，所得數據采用±s表示，采用單項方差分析，鄧肯氏多重檢驗用來確定數據間的顯著性差異，顯著水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 苦瓜提取物抑制3T3-L1前脂肪細胞生長

圖1 苦瓜提取物對3T3-L1前脂肪細胞活力影響Fig.1 Cytotoxic effect of bitter melon extracts on 3T3-L1 cells

如圖1所示，苦瓜提取物對3T3-L1前脂肪細胞有明顯抑制增殖作用，隨著提取物質量濃度的升高（0.1～0.8 mg/mL），其抑制細胞能力增強，劑量效應關系明顯；0.2 mg/mL正丁醇提取物處理組細胞存活率為79.2%，0.4 mg/mL質量濃度時存活率為53.2%，與空白對照組相比差異達顯著水平（P＜0.05）；其中IC50劑量是（0.54±0.02）mg/mL；因而選擇0.2、0.4 mg/mL兩個質量濃度進行下一步實驗。

2.2 苦瓜提取物抑制3T3-L1細胞分化

3T3-L1細胞在分化成熟后會在細胞內聚集大量脂滴，油紅O染色可以直觀反應脂肪細胞的分化程度。由圖2可知，與空白對照組相比，苦瓜提取物處理可以明顯抑制脂肪細胞的分化，成熟的脂肪細胞中油紅O染色的脂滴減少顯著。對脂肪細胞的油紅O染料定量結果表明（圖3），苦瓜處理組可以顯著減少3T3-L1細胞內甘油三酯含量（P＜0.05），其中0.2 mg/mL苦瓜提取物處理組細胞脂肪含量只有空白對照組的57.1%。以上結果表明苦瓜提取物顯著抑制3T3-L1細胞分化，且其抑制作用不是細胞毒性引起的。

圖2 苦瓜提取物對3T3-L1脂肪細胞形態的影響（×100）Fig.2 Morphological micrographs of 3T3-L1 adipocytes after incubation with bitter melon extracts (× 100)

圖3 不同質量濃度苦瓜提取物對3T3-L1脂肪細胞分化的影響Fig.3 Effect of different concentrations of bitter melon extracts on differentiation of 3T3-L1 adipocytes

2.3 苦瓜提取物對3T3-L1細胞脂肪沉積相關轉錄因子的調控

圖4 苦瓜提取物對3T3-L1細胞中脂肪沉積相關轉錄因子基因表達的影響Fig.4 Effects of treatment with bitter melon extracts on mRNA expression of genes associated with transcriptional regulation during differentiation of 3T3-L1 adipocytes

利用RT-PCR，檢測苦瓜提取物處理對3T3-L1細胞脂肪沉積相關轉錄因子mRNA表達作用。如圖4所示，C/EBPα和PPARγ是前脂肪細胞分化的關鍵調節轉錄因子；苦瓜正丁醇提取物可以顯著下調兩種基因mRNA表達量，其中0.2 mg/mL苦瓜提取物處理組分別下降為空白對照組的16%和42%，差異顯著（P＜0.05）。苦瓜提取物還可以顯著降低SREBP-1c基因表達，其中0.2 mg/mL苦瓜提取物處理組下降為空白對照組的8%，差異顯著（P＜0.05）。

2.4 苦瓜提取物對3T3-L1細胞脂肪代謝相關基因的調控

圖5 苦瓜提取物對3T3-L1細胞脂肪代謝相關基因表達的影響Fig.5 Effects of treatment with bitter melon extracts on mRNA expression of genes associated with lipid metabolism during differentiation of 3T3-L1 adipocytes

如圖5所示，與空白對照組相比，不同質量濃度苦瓜提取物處理均可顯著下調細胞脂肪代謝相關基因mRNA表達，差異顯著（P＜0.05）。其中0.4 mg/mL苦瓜提取物處理組對脂肪酸合成基因GLUT4（為空白對照組8%）、ACC1（為空白對照組13%）和Fasn（為空白對照組21%）的mRNA表達抑制明顯；對脂肪酸吸收基因AP2（為空白對照組11%）和LPL（為空白對照組14%）下調顯著。通過抑制脂肪酸合成基因表達，減少脂肪的形成；同時，抑制脂肪酸吸收關鍵基因AP2和LPL表達可以減少機體對飲食來源的脂肪酸的吸收。

3 討 論

近年來研究表明，苦瓜具有明顯減肥功效，其中正丁醇相提取物具有抑制脂肪沉積活性。苦瓜正丁醇提取物主要活性成分是三萜類化合物，而三萜類化合物具有抗炎、抗糖尿病、抗肥胖、抗氧化、抗菌等生物和藥理活性[16]。本研究中，苦瓜正丁醇提取物主要含有各種三萜類化合物[11]，它可以顯著降低3T3-L1前脂肪細胞的增殖；并顯著減少分化的脂肪細胞中脂肪沉積，降低細胞內甘油三酯含量。脂肪沉積包括脂肪組織中脂肪細胞的增殖和前脂肪細胞分化，抑制脂肪沉積可以有效減少細胞內甘油三酯含量，起到減肥的效果[2]。Popovich等[14]流式細胞術研究表明苦瓜正丁醇提取物能將3T3-L1前脂肪細胞阻滯在G2/M期，從而抑制脂肪沉積；而苦瓜種子提取物可以抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖和減少脂肪細胞中的脂肪沉積[17]；Nerurkar等[18]證實苦瓜汁可以顯著降低人脂肪細胞中脂肪含量。

在3T3-L1細胞分化研究已發現，脂肪沉積是一個高度精細的調控過程，多種轉錄因子（如C/EBPα、PPARγ、SREBP-1c等）和脂質代謝蛋白（如Fasn、ACC1、GLUT4、LPL和AP2等）[3,18]在其中發揮重要的作用。其中C/EBPα和PPARγ的過表達可以誘導并加快脂肪細胞分化，而SREBP-1c在前脂肪細胞分化早期發揮重要作用[3]。本研究中，苦瓜正丁醇提取物可以顯著抑制脂肪細胞中C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表達，從而一定程度抑制了前脂肪細胞的分化；而Popovich等[14]研究表明PPARγ基因表達下調可能引起3T3-L1細胞內脂肪沉積減少。Fasn、ACC1、GLUT4和LPL是脂肪酸合成途徑中關鍵酶，在脂肪沉積中發揮了重要作用[19]，石榴皮提取物可以通過抑制FAS酶活力而起到減肥效果[20]。本研究結果表明，苦瓜正丁醇提取物在mRNA水平對Fasn、ACC1和GLUT4表達下調顯著，從而顯著減少細胞內三酰甘油脂滴生成；同時抑制脂肪酸吸收關鍵基因AP2和LPL表達，從而減少細胞對外界環境中脂肪酸的吸收。

總之，實驗結果表明苦瓜正丁醇提取物具有一定減肥效果。苦瓜正丁醇提取物能夠顯著抑制3T3-L1細胞分化，減少細胞脂肪沉積，可能通過減少轉錄因子C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c的mRNA表達量，下調脂肪酸代謝基因GLUT4、ACC1、Fasn、AP2和LPL的mRNA表達實現。因而推測苦瓜正丁醇提取物通過調節脂肪酸代謝途徑相關基因和轉錄因子mRNA表達，從而抑制脂肪沉積，同時提示苦瓜在肥胖的預防治療中具有潛在的價值。

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Anti-adipogenic Effects of Bitter Melon Extracts in 3T3-L1 Adipocytes

QU Wei, CHEN Yan-guang, WU Zu-qiang, WANG Xin
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Bitter melon (Momordica charantia) has been shown to ameliorate high-fat diet-induced obesity, but the underlying molecular mechanisms are still unknown. The objective of this study was to elucidate the effect of bitter melon extracts on adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was used to measure cell viability; Oil red O staining and spectrometric determination were carried out to investigate the effect of bitter melon extracts on adipocyte differentiation.The mRNA expression levels of adipogenic genes were measured by real time-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results revealed that bitter melon extracts markedly inhibited lipid accumulation. The n-butanol fraction blocked the expression of adipogenic transcription factors, including peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ), ccaat-enhancer-binding protein-alpha (C/EBPα) and sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) at the mRNA level. Moreover, the mRNA levels of 5 key lipogenic enzymes including glucose transporte r-4 (GLUT4), acetyl-CoA carboxylase (ACC1) fatty acid synthase (Fasn), adipocyte protein 2 (AP2) and lipoprotein lipase (LPL) were down-regulated. These results indicate that the n-butanol fraction of bitter melon suppresses adipocyte differentiation and lipid accumulation through inhibiting the transcription of adipogenic genes and may have applications for the treatment of obesity.

bitter melon; adipogenesis; 3T3-L1 adipocytes

TS201.4

A

1002-6630（2014）05-0188-05

10.7506/spkx1002-6630-201405037

2013-05-16

教育部高等學校博士點新教師類專項科研基金項目（20110111120025）；安徽省教育廳自然科學研究重點項目（KJ2011A214）

屈瑋（1979—），男，講師，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：quweiok@126.com