小米谷糠多肽對肝損傷及癌前病變的抑制作用

于書佳，王常青*，原 敏，連偉帥，訾 艷，陳曉萌，郝志萍

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030 006）

小米谷糠多肽對肝損傷及癌前病變的抑制作用

于書佳，王常青*，原 敏，連偉帥，訾 艷，陳曉萌，郝志萍

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030 006）

目的：觀察小米谷糠多肽的抗腫瘤和抑制化學性肝損傷作用。方法：分別用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、537酸性蛋白酶水解小米谷糠，得到3種多肽；先用噻唑藍法檢測3種谷糠多肽的體外抗腫瘤作用，然后用抗腫瘤效果最好的多肽喂食經氨基比林-NaNO2誘導的肝損傷小鼠，并作肝組織學觀察。結果：當菠蘿蛋白酶水解的谷糠多肽質量濃度為50 mg/mL時，S180和H22腫瘤細胞的抑制率可達到56.28%和53.73%，該多肽在10 g/（kg·d ）劑量可顯著降低小鼠肝臟丙二醛含量和血清谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性（P＜0.01），并提高肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性（P＜0.01）。組織切片顯示，模型組小鼠肝細胞損傷嚴重，谷糠多肽高劑量組動物的肝細胞形態基本正常。結論：菠蘿蛋白酶水解的谷糠多肽具有抑制肝損傷及癌前期病變的作用。

小米谷糠多肽；氨基比林；抗腫瘤；肝損傷；肝癌前病變

小米谷糠是小米在加工過程中的副產品，其中含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維、B族維生素、VE等營養素[1]。小米谷糠多肽（millet bran polypeptide，MBPE）是蛋白酶水解小米谷糠中蛋白的產物，由多種小分子肽和少量游離氨基酸組成。腫瘤是當今發病率很高的疾病，而且死亡率還在逐年遞增，食療已成為預防及治療癌癥的一種重要輔助手段，尋找高效、安全的抗腫瘤輔助食品是當前的研究熱點之一。在國內外，已經有玉米多肽和大豆低聚肽等植物多肽抗腫瘤的研究報道[2]，但目前對小米谷糠的研究極少，尚未見到用小米谷糠研制抗腫瘤肽的研究報道。

本實驗比較小米谷糠水溶性蛋白經菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和537酸性蛋白酶3種酶多肽的體外抗腫瘤作用及抑制肝組織癌前期病變的效果（已申報發明專利），為小米谷糠多肽保健食品的開發和研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠，6周齡，SPF級，（20±2）g，購于山西醫科大學動物中心。

S180、H22細胞購自山西省腫瘤醫院。

脫脂小米谷糠，由山西榆次黃彩苑農業食品科技有限公司提供。

菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、537酸性蛋白酶 廣西龐博生物工程有限公司；氨基比林 成都西亞化工股份有限公司；注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；RPMI1640培養基 美國Gibco公司；噻唑藍、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；青鏈霉素混合液 Solarbio公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST） 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱 北京中科環試儀器有限公司；冷凍高速離心機 賽默飛世爾科技有限公司；Leica RM2255切片機 德國徠卡儀器公司；生物顯微鏡 日本Olympus公司；SephadexG-25凝膠分子篩層析柱 上海亞榮生化儀器廠；UVD-680-3紫外檢測儀和色譜工作站 上海金達生化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MBPE的制備方法

取一定量脫脂米糠，按料液比1∶10（m/V）浸提水溶性蛋白，經透析脫鹽后，分別用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和537酸性蛋白酶在各自最適水解條件下對其酶解，水解液90 ℃滅酶，冷卻后，4 500 r/min離心收集多肽上清液備用。

1.3.2 3種MBPE的分子質量測定[3]

上述多肽的分子質量分布采用Sephadex G-25凝膠色譜法測定，檢測儀波長為280 nm。以胰島素、桿菌肽和還原型谷胱甘肽作為Marker。以Marker的分子質量對數為橫坐標（X）、Marker的洗脫體積（Y）為縱坐標制作標準曲線回歸方程：Y=－47.25X＋220.4（R2=0.998 7）。對質量濃度為10 mg/mL的MBPE進行Sephadex G-25凝膠色譜分析，通過峰面積歸一法計算出MBPE的分子質量分布范圍。

1.3.3 氨基酸組成與谷胱甘肽含量分析

氨基酸組成與谷胱甘肽含量委托山西糧食質量檢測中心檢測。氨基酸分析依據GB/T5511—2008《谷物和豆類 氮含量測定和粗蛋白質含量計算 凱氏法》進行檢驗。谷胱甘肽含量采用熒光光度法[4]檢測。

1.3.4 MBPE對S180、H22腫瘤細胞的體外抑制實驗

參照文獻[5]，將S180、H22細胞置于含100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1%青鏈霉素混合液、10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃、5% CO2環境下培養。取對數生長期的S180、H22腫瘤細胞，將細胞濃度調為5×104個/mL[6]。文獻[7]報道，環磷酰胺是一種常用的廣譜抗癌化療藥物，抗癌機制主要表現在直接破壞DNA并阻止其復制，常用作抗腫瘤實驗對照品。預實驗表明，環磷酰胺、MBPE的質量濃度為10 mg/mL以上時有抑制S180、H22細胞株的作用，因此，陽性對照組加入20 mg/mL的環磷酰胺100 μL、實驗組加入等體積的MBPE（10、30、50 mg/mL），對照組加等體積的培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，棄去上清液，每孔加5 mg/mL的噻唑藍10 μL，繼續培養4 h，棄上清后每孔加入DMSO 200 μL，輕輕振搖10 min，在波長550 nm處測光密度值。計算3種小米糠多肽對腫瘤細胞生長抑制率，選取對S180、H22腫瘤細胞增殖抑制率最高的一種小米谷糠多肽，進行下一步小鼠抗肝損傷及癌前病變的抑制實驗。

1.3.5 MBPE抑制小鼠肝損傷及癌前病變方法

1.3.5.1 動物分組與處理

小鼠適應性喂養后，隨機分為基礎組、模型組、陽性對照組、小米糠多肽高劑量組、低劑量組，每組10只。實驗期間，基礎組、模型組、陽性對照組喂食基礎飼料，高、低劑量組分別按10、4 g/（kg· d）喂食多肽，陽性對照組隔天灌胃環磷酰胺20 mg/kg。除基礎組外，其他組小鼠灌胃氨基比林和NaNO2各80 mg/（kg·d），實驗共13周。實驗過程中每日觀察記錄小鼠進食狀況、活動及外表征象，每周稱量鼠體質量。

1.3.5.2 血清中ALT和AST活性測定方法

實驗第84天，小鼠禁食12 h。稱體質量，各組動物眼眶取血后，全血1 500 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒標注的方法測定血清ALT和AST的活性。

1.3.5.3 肝臟中MDA含量和GSH-Px活性測定

結束實驗后，小鼠脫臼處死，切取適量的肝組織，冰水浴中用4 ℃生理鹽水將其制成10%的肝勻漿，4 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液，按照試劑盒的說明測肝組織MDA含量和GSH-Px活性。

1.3.5.4 肝組織形態學觀察

取小鼠肝臟右葉的相同部位，用10%的中性甲醛固定，包埋，切片，HE染色。用普通光鏡觀察、記錄組織形態。

1.4 統計分析

實驗數據使用SPSS17.0軟件處理與方差分析。

2 結果與分析

2.1 3種MBPE的分子質量分布范圍

圖1 3種MBPE的Sephadex G-25凝膠洗脫圖譜Fig.1 Elution profiles of three MBPEs on Sephadex G-25 column

由圖1可知，不同蛋白酶水解的多肽分子質量分布存在較大差異，通過峰面積歸一法分析得到3種多肽的分子質量分布，其中菠蘿蛋白酶酶解MBPE＜1 000 D的比例最高，高達89.47%；而木瓜蛋白酶和537酸性蛋白酶酶解MBPE分子質量＜1 000 D分別占70.28%和53.64%。具體數據統計見表1。

表1 3種MBPE的分子質量分布范圍Table 1 Molecular weight distribution of three MBPEs

2.2 3種MBPE的氨基酸組成與谷胱甘肽含量分析

表2 3種MBPE的氨基酸組成與谷胱甘肽含量Table 2 Amino acid composition and GSH content of three MBPEs Table 2 Amino acid composition and GSH content of three MBPEs

一般谷物食品中亮氨酸的含量為5%左右，由表2可見，而3種MBPE中亮氨酸含量均較高，菠蘿蛋白酶酶解多肽的亮氨酸含量最高，為11.67%；這和菠蘿蛋白酶酶解MBPE抗腫瘤作用較好可能有一定關系。精氨酸在體內可以通過轉化為NO而抑制腫瘤細胞的合成[8]，在3種MBPE中，精氨酸的含量比一般谷物食品多，可能與MBPE的抗腫瘤作用有聯系。本實驗的菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和537酸性蛋白酶3種酶水解多肽的谷胱甘肽含量均遠高于大豆肽溶液中谷胱甘肽的含量（28.5 μg/mL）[9]。研究證實，谷胱甘肽具有保肝解毒和抗氧化的生理功能，已用于肝病和抗腫瘤等臨床治療[10]。

2.3 MBPE體外抑制S180、H22腫瘤細胞的作用分析

表3 3種MBPE對S180、H22腫瘤細胞的抑制率Table 3 le 3 in vitro itro Inhibitory effects of different polypeptides on S180 and H22

由表3可知，3種酶解多肽對S180、H22腫瘤細胞珠均有抑制作用，并且其抑制率隨著多肽質量濃度的增加而升高，以上3種蛋白酶解物對腫瘤細胞生長的抑制率，高低順序為菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、537酸性蛋白酶。當質量濃度為50 mg/mL時，菠蘿蛋白酶MBPE對S180、H22腫瘤細胞生長的抑制率分別為56.28%、53.73%；木瓜蛋白酶MBPE的抑制率為43.31%、41.27%；而537酸性蛋白酶MBPE的抑制率為28.36%、29.53%。通過以上3種蛋白酶酶解多肽的體外抗腫瘤實驗，選取效果最好的菠蘿蛋白酶酶解MBPE，作為下一步抑制小鼠化學性肝損傷及癌前期病變的材料。

2.4 小米糠多肽抑制氨基比林-NaNO2誘導小鼠肝癌前期病變實驗結果

2.4.1 小鼠血清和肝臟生化指標分析

由表4可知，模型組與基礎組小鼠相比，肝組織MDA含量、血清AST和ALT活性均顯著增高，肝臟GSH-Px活性顯著下降（P＜0.01），說明肝臟受到了過氧化攻擊，其抗氧化能力受到嚴重破壞[11]，說明肝損傷和癌前病變建模成功。與模型組相比，陽性對照組的肝組織MDA含量、GSH-Px活性、血清AST和ALT活性均存在顯著差異（P＜0.01或P＜0.05），與基礎組處于同一水平，說明環磷酰胺具有抑瘤作用。與模型組相比，MBPE高劑量組肝臟MDA含量、血清AST、ALT活性極顯著降低，肝臟GSH-Px活性明顯升高（P＜0.01）；MBPE低劑量組MDA含量、血清AST、ALT活性顯著降低（P＜0.05），肝臟GSH-Px活性升高（P＜0.05）。由此可知，MBPE高、低劑量組對氨基比林-NaNO2誘導的肝損傷或癌前期病變的小鼠均有抑制作用，且MBPE高劑量組抑制效果更明顯。

表4 MBPE對小鼠血清AST、ALT和肝臟MDA、GSH-Px的影響（x±s，n=10）Table 4 Effect of the strongest antioxidant MBPE on serum AST and ALT as well as hepatic MDA and GSH-Px in mice（x±s, n = 10）

2.4.2 小鼠肝組織切片分析

圖2 氨基比林-NaNO2致小鼠肝組織形態學變化比較（×220000）Fig.2 Morphological changes of mouse liver tissue induced by AP-NaNO2(× 200)

由圖2可知，基礎組小鼠肝細胞大小均勻，分布規則，肝小葉內網狀纖維支架完整，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，細胞核圓，核膜清楚，無壞死或變性。模型組小鼠肝細胞有明顯的變性與增生現象[12]，肝細胞出現異常增生，渾濁且體積增大，染色深淺不同，肝索排列相對紊亂，肝小葉內部分肝細胞壞死，匯管區可見淋巴細胞浸潤，胞漿內出現輪廓不清晰的細小顆粒。環磷酰胺陽性對照組肝細胞形態與基礎組相比，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，但細胞大小有差異，核膜不夠清晰，但肝組織形態基本正常。MBPE高劑量組肝細胞病變性質與模型組相比，其病變程度明顯減輕，肝索略呈放射狀排列，細胞異型性增生程度減小，雙核細胞明顯少見，肝小葉未見大片的壞死細胞。MBPE低劑量組肝細胞病變性質與模型組類似，但其病變程度稍有減輕，肝索排列相對整齊，細胞異常增生程度減小，匯管區可見淋巴細胞浸潤。以上分析表明，MBPE高劑量組可顯著減輕氨基比林-NaNO2誘導小鼠的肝損傷，從而抑制其肝癌前期病變。

3 討 論

我國是世界上最大的小米生產國家，每年加工小米產生的小米谷糠大約40萬t[13]，如果將小米谷糠中的蛋白加工成功能性多肽食品，可以大大提高小米谷糠的經濟效益和利用率，并減少浪費與污染。據相關資料報道，一些特定的小分子肽易于穿透腫瘤細胞，通過巨噬細胞與腫瘤細胞相互作用抑制腫瘤的生長[14]，因此，小分子多肽含量高的多肽往往抗腫瘤效果較好[15]。本實驗得到的3種多肽中的小分子肽比例都較高，其中菠蘿蛋白酶酶解MBPE中，＜1 000 D多肽的比例最高，為89.47%，抗腫瘤效果也最好，這可能與該多肽中小分子抗腫瘤肽較多有聯系。目前尚未確定MBPE中抗腫瘤寡肽的分子組成和氨基酸序列，可能與MBPE中亮氨酸、精氨酸和谷胱甘肽含量較高有重要的關系。有研究表明[16]，亮氨酸具有螯合金屬離子的作用，通過降低金屬離子的氧化還原電勢，減小金屬離子的催化氧化，達到抗氧化作用，提高肽的抗氧化能力有助于抑制肝損傷。精氨酸能抑制腫瘤細胞的多胺生物合成，進而抑制腫瘤細胞核酸和蛋白質的合成；谷胱甘肽可以通過抗氧化、解毒起到抵抗化學性肝損傷和癌前病變的作用。

亞硝胺是一種強化學致癌物，小鼠在亞硝胺誘導22周后產生肝癌[17]，但亞硝胺建模過程中會出現大量動物死亡。本實驗采用氨基比林-NaNO2建立化學性肝損傷和癌前期組織病變模型，與亞硝胺誘癌相比，具有實驗時間短，癌前期組織病變明顯和動物死亡率低的優點。有研究證明[18]，隨著實驗時間的推移。氨基比林-NaNO2所致肝損傷細胞會惡變，生物膜上的脂質過氧化損傷程度加重，最終導致肝癌的形成。肝損傷或病變肝細胞受損動物往往表現為血清AST、ALT活性異常升高；而肝損傷和癌前病變小鼠的肝組織往往表現為脂質過氧化嚴重，抗氧化酶活性下降，GSH-Px活力下降和MDA含量顯著增高[19-20]。本研究通過喂食菠蘿蛋白酶酶解MBPE，可顯著抑制AST、ALT活性和MDA含量升高，顯著升高GSH-Px活力，因此具有一定的抗肝損傷和癌前期病變作用。MBPE在10 g/（kg·d）劑量時對氨基比林-NaNO2誘導的肝損傷及癌前期病變有明顯抑制作用，可以開發為保健食品或抗腫瘤藥品原料。

[1] 趙陳勇, 王常青, 許潔, 等. 小米谷糠油降血脂和抗氧化作用的研究[J].中國糧油學報, 2012, 27(7): 67-70.

[2] 朱艷華. 玉米多肽的制備、理化性質及生物活性的研究[D]. 武漢:華中農業大學, 2007: 1-8.

[3] 劉志國, 吳瓊, 呂玲肖. 酶解米糠蛋白分離提取 ACE抑制肽及其結構研究[J]. 食品科學, 2007, 28(3): 223-227.

[4] 陳儉梅, 周琳. 幾種谷胱甘肽的檢測方法[J]. 山東食品發酵, 2007(3): 26-29.

[5] 曾永長, 梁少瑜, 羅佳波, 等. 白花蛇舌草水提部位體內外抗腫瘤實驗研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2011, 22(5): 521-524.

[6] HAMID R, ROTSHTYN Y, RABADI L, et al. Comparison of alamar blue and MTT assays for high through-put screening[J]. Toxicol in Vitro, 2004, 18(5): 703-710.

[7] 遲淑萍, 白冰珂, 謝進, 等. 環磷酰胺在動物模型體內抗腫瘤影響及抑瘤機制的研究[J]. 中國醫藥導報, 2012, 9(14): 20-22.

[8] BRATT J, ZEKI A, LAST J, et al. Competitive metabolism of L-arginine: arginase as a therapeutic target in asthma[J]. Journal of Biomedical Research, 2011, 25(5): 299-308.

[9] 郭黎平, 劉國良, 張卓勇, 等. 熒光光度法測定大豆提取液中還原型谷胱甘肽[J]. 東北師范大學學報: 自然科學版, 2001, 33(1): 34-38.

[10] 王朝霞. 還原型谷胱甘肽對化療藥物性肝功能損害的防治作用[J].中外醫療, 2012(8): 87-89.

[11] 焦藝博, 劉曉婷, 毛文超, 等. 姜黃素對二乙胺基亞硝胺誘發小鼠肝癌前病變的預防作用[J]. 中國藥師, 2012, 15(9): 1218-1221.

[12] HUANG Baoxu, WANG Hongbin, QU Zhina, et al. Study on the antitumor effects of low-energy laser irradiation combined with cyclophosphamide[J]. 東北農業大學學報: 英文版, 2003, 10(1): 43-38.

[13] 趙陳勇, 王常青, 許潔, 等. 富含甾醇小米谷糠油提取工藝研究[J].中國油脂, 2011, 36(7): 12-14.

[14] 張冉, 勞興珍, 鄭珩. 抗腫瘤小分子多肽的研究進展[J]. 氨基酸和生物資源, 2012, 34(4): 42-46.

[15] 呂方, 米沙, 王士賢, 等. 酶法制備大豆多肽的分子量分布和抑瘤實驗觀察[J]. 營養學報, 2008, 30(3): 274-277.

[16] 周薇, 胡世蓮. 氨基酸與腫瘤[J]. 中國臨床保健雜志, 2007, 10(2): 209-211.

[17] 周崢珍, 章宗籍, 錢忠義, 等. DEN誘發大鼠肝癌模型的實驗病理研究[J]. 昆明醫學院學報, 2005(3): 15-19.

[18] 楊錯, 劉玉蘭, 張紅梅. 肝細胞損傷機制及防治藥物研究進展[J]. 實驗藥物與臨床, 2005, 8(6): 44-46.

[19] HUANG Haili, WANG Yajing, ZHANG Qingyu, et a1. Hepatoprotective effects of baicalein against CCl4-induced acute liver injury in mice[J]. World Journal Gastroenterol, 2012, 18: 6605-6613.

[20] KUSHIDA M, KAMENDULIS L M, PEAT T J, et al. Dose-related induction of hepatic preneoplastic lesions by diethylnitrosamine in C57BL/6 mice[J]. Toxicol Pathol, 2011, 39(5): 776-786.

Inhibitory Effect of Millet Bran Polypeptides on Liver Injury and Precancerous Lesions

YU Shu-jia, WANG Chang-qing*, YUAN Min, LIAN Wei-shuai, ZI Yan, CHEN Xiao-meng, HAO Zhi-ping
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Objective: This study was aimed to investigate the antitumor activity of millet bran polypeptides (MBPEs) and their inhibitory effect on chemically induced liver injury. Methods: Three kinds of polypeptides were obtained by enzymatic hydrolysis of millet bran with bromelain, papain and 537 acid protease, respectively. MTT assay was applied to detect the in vitro antitumor effect of MBPEs. The mice with hepatic injury chemically induced by aminopyrine and sodium nitrite were fed with the polypeptide with the strongest antitumor effect, and the liver was histologically observed. Results: The inhibitory rates of MBPE (50 mg/mL) prepared with bromelain on S180 and H22 tumor cells were 56.28% and 53.73%, respectively. In the high-dose MBPE group (10 g /(kg·d)), the serum level s of aspartate transaminase (AST) and alanine transam inase (ALT) and the liver content of malondialdehyde (MDA) were significantly decreased（P ＜ 0.01). The activity of liver glutathione peroxidase (GSH-Px) was signifi cantly increased（P ＜ 0.01). The histological examination of the liver tissue showed that liver cells were severely injured. However, the morphology of hepatocytes in the high-dose group was basically normal. Conclusion: The polypeptides from millet bran hydrolyzed by bromelain have sig nifi cantly inhibitory effects on liver injury and precancerous lesions.

millet bran polypeptide; aminopyrine; antitumor; liver injury; hepatic precancerous lesions

TS201.4

A

1002-6630（2014）05-0213-05

10.7506/spkx1002-6630-201405042

2013-03-17

于書佳（1989—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品開發。E-mail：shujiayu9967@163.com

*通信作者：王常青（1956—），男，教授，學士，研究方向為食品生物技術與功能食品的開發。E-mail：wcq@sxu.edu.cn