濕法糖基化改性對大豆分離蛋白功能性質的影響

王 松，夏秀芳，黃 莉，丁 一，楊 明

濕法糖基化改性對大豆分離蛋白功能性質的影響

王 松，夏秀芳*，黃 莉，丁 一，楊 明

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白與葡萄糖按質量比4∶1溶解在重蒸水中配制成蛋白質質量濃度為8 g/100 mL的混合液，分別在70、80、90 ℃條件下反應0、1、2、3、4、5、6 h，得到不同反應溫度和時間的糖基化產物。通過測定各糖基化產物的pH值、溶解性、乳化性和凝膠性質，研究糖基化對大豆分離蛋白功能性質的影響。結果表明：隨著加熱時間的延長，不同溫度反應體系的顏色加深，pH值逐漸降低，溶解性、乳化活性和乳化穩定性顯著提高，凝膠的彈性和硬度呈先上升后下降的趨勢。其中90 ℃反應體系糖基化大豆分離蛋白的功能性質提高最為明顯，從0 h到6 h，溶解性和乳化活性分別從17.37%、0.168提高到了38.7%、0.574，且效果顯著（P＜0.05）；加熱4 h制得的糖基化樣品的乳化穩定性最強，其乳化穩定性為39.6；并且糖基化樣品凝膠的硬度和彈性在反應3 h時最大，其硬度和彈性分別為81.3g和0.936。因此，糖基化修飾可有效提高大豆分離蛋白的功能性質。

大豆分離蛋白；葡萄糖；糖基化；功能性質

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是最重要的植物蛋白資源之一[1]，資源豐富、品質優良，含人體所必需的8種氨基酸，且比例比較合理，不含膽固醇，具有較高的營養價值[2]，是一種蛋白質含量在90%以上用大豆為原料制取的功能性食品添加劑[3]。盡管SPI具有一定的功能性質，但其乳化性、膠凝性等性質與某些動物源蛋白質相比仍有較大差距[4]，且其較差的溶解性限制了它在食品工業中的廣泛應用。因此需要對SPI進行改性處理，以期獲得優良功能特性。

目前用于大豆分離蛋白改性的方法很多，其中糖基化（glycosylation）修飾由于其具有自發進行、無需添加化學試劑、加熱即可加速反應等優點而成為一種較為理想的改性方法。國內外許多學者已研究發現經糖基化后的蛋白質比原蛋白在功能性質上發生很大變化。Sun Yuanxia等[5]研究表明，乳清蛋白與還原糖進行糖基化反應后，其功能性質顯著提高。Groubet等[6]在60 ℃條件下將β-酪蛋白與多種還原糖進行反應，所得產物的溶解性都得到了一定的改善。Moreno等[7]在40 ℃條件下用酪蛋白與乳糖進行糖基化反應，其產物的乳化性得到明顯改善。黃友如等[8]認為美拉德反應對大豆分離蛋白的凝膠性能有較為明顯的影響。蘇志光等[9]將大豆分離蛋白與甘露聚糖糖基化生成糖蛋白，經研究表明其溶解性顯著提高并且等電點向酸性方向偏移。但由于SPI經糖基化反應后許多氨基酸參與反應并失去了原有功能，尤其是賴氨酸，造成了營養成分的流失；并且在反應過程中產生了醛、雜環胺等有害中間產物，對安全性構成極大隱患。因此真正應用于食品加工前，應對糖基化產物的營養性和安全性進行進一步的研究。之前已有人研究了糖基化改性對蛋白質（包括SPI）功能特性的影響，但大多數都是對通過干熱法制備的多糖-蛋白復合物進行研究。因此，本實驗通過測定經濕熱法在不同時間和溫度制得的葡萄糖與大豆分離蛋白糖基化產物的溶解性、乳化性和凝膠性等，系統分析糖基化溫度和時間對其功能性質的影響，尋找出可應用于多種食品中的高性能食品添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白含量≥90%） 哈爾濱高科大豆食品公司。

葡萄糖 上海國藥集團化學試劑有限公司；九三非轉基因大豆油 九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） Solarbio公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠；721型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TGL-16C型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；AL-104型精密電子天平梅特勒-托利多（上海）儀器設備有限公司；TA-XT lus型質構儀 英國Stable Micro System公司；日本電色ZE-6000色差儀 上海首立實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖基化大豆分離蛋白的制備

分別稱取一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖，加入蒸餾水使之混合均勻，溶液中蛋白與葡萄糖的質量比為4∶1，其中蛋白質量濃度為8 g/100 mL。將上述溶液密封放置在70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中進行糖基化反應，分別反應0、1、2、3、4、5、6 h后取出一定量的樣品，冷凍干燥后用雙縮脲法測定樣品中蛋白質含量并置于4 ℃條件下保存備用。

1.3.2 糖基化大豆分離蛋白pH值的測定

在不同的反應時間，用pH計測定糖基化大豆分離蛋白的pH值。每組重復3次，取平均值。

1.3.3 糖基化大豆分離蛋白溶解性的測定

參照孫煥等[10]的雙縮脲法，并稍作修改。將樣品配制成蛋白質質量濃度1 g/100 mL的溶液，充分攪拌，3 000 r/min離心30 min，取1 mL上清液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，振蕩10 min后放置30 min，于540 nm波長處進行比色測定。

1.3.4 糖基化大豆分離蛋白乳化能力的測定

參照Tang等[11]的濁度法，并稍作修改。將樣品溶于pH 7.0的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質質量濃度為1 mg/mL，將8 mL樣品溶液和2 mL大豆油放入直徑為2.5 cm的塑料離心管中高速勻漿1 min，分別于0 min和10 min從勻漿液底部吸取50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后在500 nm波長處測定吸光度，記作A0和A10。用0.1% SDS溶液作為空白對照。用0時刻的吸光度A0表示乳化活性（emulsifying activity，EA），乳化穩定性（emulsifying stability，ES）采用如下公式計算。

1.3.5 糖基化大豆分離蛋白凝膠的制備

將樣品配制成蛋白質質量濃度15 g/100 mL的溶液，用保鮮膜密封，在90 ℃水浴鍋中加熱30 min，迅速冷卻至室溫，在4 ℃過夜貯存備用。

1.3.6 糖基化大豆分離蛋白凝膠質構（texture profile analysis，TPA）的測定

參照Ju等[12]方法，并稍作修改。凝膠室溫下放置30 min，用質構儀進行測定，探頭采用P 0.5，測試前速率：5.0 mm/s，測試速率：2.0 mm/s，測試后速率：5.0 mm/s，下壓距離為凝膠高度的50%，引發力為5 g，室溫下進行測定，每個樣品進行3次平行實驗，取平均值。

1.3.7 糖基化大豆分離蛋白凝膠色差的測定

用日本電色ZE-6000色差儀測定。用白板對設備進行校正后以未改性大豆分離蛋白凝膠為空白，測定各糖基化凝膠樣品的總色差ΔE。

1.4 統計分析

每個實驗重復3次。數據統計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件進行，使用Tukey HSD程序進行差異顯著性（P＜0.05）分析，采用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同反應時間和溫度的糖基化大豆分離蛋白pH值的變化

pH值是反映糖基化反應進行程度的重要參數[13]。由圖1可知，SPI和葡萄糖混合液的pH值略低于SPI溶液。隨著加熱時間的增加，糖基化大豆分離蛋白溶液的pH值顯著減小（P＜0.05），70、80 ℃和90 ℃反應體系中的pH值分別從0 h的7.43下降到6 h的6.97、6.90和6.76。這一結果與Lertittikul等[14]的研究結果相符合，他們研究發現蛋白質與葡萄糖反應過程中pH值隨加熱時間延長而顯著降低。此外，不同的加熱溫度對其pH值有一定的影響，溫度越高反應體系的pH值下降的越顯著。

圖1 不同加熱溫度和時間的糖基化大豆分離蛋白pH值的變化Fig. 1 Effect of glycosylation reaction temperature and time on the pH of SPI

反應體系的pH值下降可能是由于氨基的減少和產生酸所導致的[15]。大豆分離蛋白溶液呈弱堿性，可能是由于其含有較多的堿性氨基酸，有許多－NH2存在，但隨著糖基化反應的進行，葡萄糖與－NH2進行縮合反應致使氨基大量消耗。同時，在堿性條件下加熱還原糖很容易使其降解產生甲酸和乙酸等物質[16]，而且在糖基化反應過程中可能會產生多種酸。這一實驗結果也證明了大豆分離蛋白與葡萄糖發生了反應。

2.2 不同反應時間和溫度對糖基化大豆分離蛋白溶解性的影響

圖2 不同糖基化溫度和時間對大豆分離蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of glycosylation reaction temperature and time on the solubility of SPI

溶解性是大豆分離蛋白最重要的性質之一，因為它影響著其他的功能性質[17]。由圖2可知，SPI的溶解度在混入葡萄糖未經加熱時從21.23%降到了17.37%，之后隨著加熱時間的延長，不同溫度反應體系的溶解度均顯著提高（P＜0.05）。這與Achouri等[18]的研究結果一致，表明大豆分離蛋白的主要成分大豆球蛋白（11S）與葡萄糖發生糖基化反應后，在一定時間內其產物溶解性隨時間增加逐漸變大。產生這一結果的原因可能是糖類含有多個親水羥基，當蛋白與糖發生糖基化反應后，糖蛋白中會引入許多羥基而使得其溶解性增加[19]。而未經加熱的SPI和葡萄糖混合物的溶解性降低可能是因為此時兩者未發生聚合反應并且pH值降低使得SPI的溶解性降低。

2.3 不同反應時間和溫度對糖基化大豆分離蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響

乳化性是指油和水形成乳化液的能力。大豆分離蛋白是一種很優良的乳化劑，因為蛋白質具有兩親結構，同時具有親水性和親油性，但是由于未經改性的SPI溶解性較差限制了其充分發揮乳化性。由圖3可知，未經加熱的SPI與葡萄糖混合液的乳化活性和乳化穩定性均較SPI溶液降低，這可能是由于此時SPI還未與葡萄糖發生聚合，引入親水基團，而葡萄糖分子的存在卻影響了SPI在油水界面的吸附。由圖3a可知，隨著糖基化溫度和時間的增加，糖基化SPI的乳化活性顯著提高（P＜0.05），反應進行5 h后趨于平緩。劉燕等[20]也研究表明糖基化后的大豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性有不同程度的提高。這是因為SPI與葡萄糖發生聚合后，提高了其溶解性，同時聚合后的蛋白側鏈殘基具有一定的疏水性，從而使得糖基化SPI能夠快速較好地吸附在油水界面[21]。由圖3b可知，溫度不同的3個反應體系中糖基化SPI的乳化穩定性均顯著增加（P＜0.05），都呈現先增加后減小的趨勢。這可能是因為反應開始的一段時間內，隨著糖基化的進行，SPI所帶的凈電荷不斷增加，分子間的排斥增加，油水界面所行成的保護膜增厚，從而乳化穩定性得到了提高，但隨著反應時間的延長，分子質量較小的葡萄糖提供的空間穩定作用不夠[22]，或可能在反應后期產生的副產物（褐變產物）影響了其乳化穩定性。

圖3 不同糖基化溫度和時間對大豆分離蛋白乳化活性（a）和乳化穩定性（b）的影響Fig.3 Effect of glycosylation reaction temperature and time on the emulsifying activity (EA) (a) and emulsion stability (ES) (b) of SPI

2.4 不同反應時間和溫度對糖基化大豆分離蛋白凝膠性質的影響

2.4.1 對糖基化大豆分離蛋白凝膠硬度和彈性的影響

圖4 不同糖基化溫度和時間對大豆分離蛋白凝膠硬度（a）和彈性（b）的影響Fig.4 Effect of glycosylation reaction temperature and time on the hardness (a) and springiness (b) of SPI gel

凝膠性是大豆分離蛋白應用較多的性質之一。因為熱誘形成球蛋白凝膠網絡能保持住水、脂類、風味物質、色素等成分，使它們穩定地保留在分散相中[23]。由圖4可知，糖基化SPI隨著加熱時間的延長其硬度和彈性都呈現出先增加后降低最終趨于平穩的趨勢，并且不同溫度的反應體系中均在3 h時出現硬度和彈性最大值，其中硬度和彈性最大值分別出現在90 ℃和70 ℃反應體系中。蛋白質凝膠的形成是蛋白質分子聚集的過程，當鄰近肽鏈之間的排斥力和吸引力處于平衡狀態，形成能保持大量水分的高度有序的三維網絡結構或基體，其中蛋白質分子聚集的先決條件是蛋白質構象改變[24]。并且張華江等[25]研究發現維持大豆分離蛋白凝膠結構的主要作用力是疏水相互作用和分子間的二硫鍵。因此，得到這一結果可能是由于在糖基化反應開始階段隨著加熱時間的延長，反應體系中pH值下降，誘導蛋白質構象發生改變，使蛋白質分子聚集，同時隨著糖基化程度增加，葡萄糖共價結合到蛋白質分子上，使長鏈疏水性基團的含量增加，增強了疏水相互作用力，使凝膠的硬度和彈性逐漸上升；但當糖基化達到一定程度后，分子間二硫鍵減少并且分子空間位阻增強，同時隨著糖基化的進行也會有蛋白-蛋白間的聚合，破壞肽鏈間排斥力與吸引力的平衡，從而導致凝膠硬度和彈性又開始下降。

2.4.2 對糖基化大豆分離蛋白凝膠色差的影響

色差（ΔE）是以未改性的大豆分離蛋白凝膠為空白，測得不同糖基化時間和溫度的SPI凝膠與其顏色的差異，從而反映出糖基化大豆分離蛋白的褐變程度和凝膠的感官。由圖5可知，隨著加熱時間的增加，各反應體系的色差值（ΔE）均逐漸變大，其中90 ℃反應體系的色差值變化尤其顯著（P＜0.05），5 h后ΔE值極速上升，說明這時可能開始大量產生褐變產物。因為美拉德褐變產物褐色聚合體——類黑精是在美拉德反應的最后階段產生的[26]。反應時間越短，糖基化產物的顏色越淺。這一結果與Tian Shaojun等[1]的研究一致。同時，反應溫度越高，褐變程度越大，這可能是因為反應溫度高會加速糖基化反應的進行，更早的到達產生褐變產物的階段，產生更多的類黑精。糖基化大豆分離蛋白作為一種食品添加劑，如果顏色過深會影響食物的感官，并且有研究表明類黑精可能會導致糖尿病，而且在美拉德反應的最后階段還會產生抗營養或有毒的物質，因此在實際生產中應注意控制糖基化條件。

圖5 不同糖基化溫度和時間對大豆分離蛋白凝膠色差的影響Fig.5 Effect of glycosylation reaction temperature and time on the chromatic aberration of SPI gel

3 結 論

大豆分離蛋白與葡萄糖隨著糖基化溫度的升高（70、80、90 ℃）、時間的延長（0～6 h）酸度和褐變程度逐漸增強。通過對各反應體系中制得的糖基化大豆分離蛋白功能特性的研究，結果表明：與未經處理的SPI

相比，經糖基化改性的SPI的溶解性、乳化活性和乳化穩定性均顯著提高，凝膠的彈性和硬度在特定條件范圍內明顯提升，凝膠的顏色隨反應進行逐漸加深。這說明濕法葡萄糖糖基化有效地提高了大豆分離蛋白的功能性質。糖基化SPI將成為食品工業中一種多功能綠色的添加劑，使SPI應用于更廣闊的領域。但在應用前要在糖基化對SPI正反兩方面影響之間找到一個最佳平衡點。

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Effect of Glycosylation under Wet-Heating Condition on Functional Properties of Soybean Protein Isolate

WANG Song, XIA Xiu-fang*, HUANG Li, DING Yi, YANG Ming
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The effect of glycosylation under wet-heating conditions on functional properties of soybean protein isolate (SPI) was investigated by determining the pH, solubility and gel propert ies of glycosylated products from the reaction between 8 g/100 mL of SPI and glucose with a weight ratio of 4:1 in double distilled water at 70, 80 and 90 ℃ for 0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 h, respectively. The results showed that the color of the model system at each temperature became darker with extended heating time, the pH was decreased, the sobubility, emulsifying activity and emulsion stability were signifi cantly improved (P ＜ 0.05), and the gel springiness and hardness tended to initially increase and then decrease. The most obvious improvement was observed when the glycosylation reaction temperature was 90 ℃. The solubility and emulsifying activity were increased from 17.37% and 0.168 at 0 h to 38.7% and 0.574 at 6 h, and the highest gel hardness and springiness, 81.3 g and 0.936 were obtained at 3 h. Hence, glycosylated modifi cation can effectively improve functional properties of soy protein isolate.

soybean protein isolate; glucose; glycosylation; functional properties

TQ936.2

A

1002-6630（2014）09-0038-05

10.7506/spkx1002-6630-201409009

2013-04-14

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102208）；黑龍江省博士后資助項目（LBH-Z11212）

王松（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：wangsong370@163.com

*通信作者：夏秀芳（1973—），女，副教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：xxfang524@163.com