苦丁茶多糖活性成分動態累積及其抑菌活性

蔡 鵑，黃敏桃，黃云峰，賴茂祥，黃榮韶，劉華鋼，黃庶識

苦丁茶多糖活性成分動態累積及其抑菌活性

蔡 鵑1,2，黃敏桃1,2，黃云峰3，賴茂祥3，黃榮韶4，劉華鋼5，黃庶識1,*

（1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西 南寧 530007；2.贛州衛生學校藥學系，江西 贛州 341000；3. 廣西中醫研究院，廣西 南寧 530022；4.廣西大學農學院，廣西 南寧 530 004；5.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

目的：研究苦丁茶（Ilex kudingcha C. J. Tseng.）中主要抑菌活性成分多糖在不同采收月份的動態累積規律。方法：將不同采收期的苦丁茶葉水浴回流提取3次，用杯碟法分別測定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌3種菌的抑菌圈直徑，比較不同采收期苦丁茶水提物抑菌圈直徑大小，確定最佳采收期。通過苯酚硫酸法測定不同采收期苦丁茶提取物中多糖含量，分析多糖含量與苦丁茶抑菌能力之間相關性；同時采集不同采收期紅外光譜，分析與多糖相關的特征峰強度變化規律及其與抑菌活性之間的相關性。結果：在一年的不同月份生長期內，苦丁茶多糖含量在1—3月份逐漸增加，4月份達到最大值96.6 mg/g，然后呈緩慢下降的趨勢，7—10月變化不大，11月份后含量顯著降低，12月達到全年最低值47.7 mg/g。苦丁茶水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌3 種菌的抑制作用在4月份最大， 12月份最小，與苦丁茶多糖 含量的變化規律基本一致。結論：苦丁茶抑菌活性多糖成分4月份含量最高，為最佳采收期；苷類和多糖為苦丁茶抑菌活性成分。

苦丁茶；采收期；多糖活性成分；紅外光譜；抑菌活性

苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C. J. Tseng.）作為一種廣西道地主產的藥食兩用的大宗優勢產品，早已成為廣西乃至我國華南地區的傳統特色產品。研究表明，飲用苦丁茶具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、抗衰老、活血脈、調節血脂等生理活性[1]，民間應用歷史悠久。利用苦丁茶的抑菌作用，民間常在飼料中添加苦丁茶葉以預防雞瘟，且常飲用苦丁茶可達到清除口腔牙周病原菌[2]、抑制幽門螺旋 桿菌生長，治療慢性胃炎等藥理效果[3]。隨著人類社會的發展，抗生素、激素大量不合理的使用，會對人體健康造成損害，近年來科學工作者已經轉向中草藥中有效天然抑菌成分的研究，從天然中草藥中篩選食品添加劑也越來越受到國內外學者的廣泛關注[4-5]。苦丁茶中含有多種藥效成分和營養成分，主要為皂苷、黃酮、多糖等化學成分，如槲皮素、山奈素、熊果酸、齊墩果酸、苦丁茶多糖、多種微量元素等[6-9]。這些成分為苦丁茶中天然抑菌成分、天然食品添加劑的篩選提供了物質基礎[10]，且苦丁茶為日常飲用品，長期安全使用無毒副作用。林雄平等[11]以及本實驗前期研究表明，苦丁茶抑菌的抑菌活性與其茶多糖含量密切相關，但尚未見有關苦丁茶抑菌活性和多糖含量隨季節變化規律的報道。本研究采用杯碟法測定不同采收期苦丁茶提取物的抑菌能力，比較不同采收期苦丁茶多糖含量和抑菌活性的相關性，為確定苦丁茶原材料的適宜采收期，并為更好地綜合評價苦丁茶原材料的質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌種

苦丁茶樣品于2011年7月采自廣西南寧市地委大院，樹齡25年，經廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定為冬青科冬青屬苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C. J. Tseng.），采2年枝條成熟葉，采回后陰干，取其干燥葉片粉碎、烘干，置于干燥器保存待用。

硫酸（分析純） 廉江市愛廉化試劑有限公司；MH瓊脂培養基、MH肉湯、營養肉湯均為廣東環凱公司；牛津杯 河北新鄉精密儀器廠；0.22 μm微孔濾膜天津津騰公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC44102）；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）（ATCC26003）；綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC27583）購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection）。

1.2 儀器與設備

UV-2601雙光束紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；DW-40L92藥品保存箱 青島海爾公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；HPX-9082MBE數顯電熱培養箱 上海博迅實業有限公司；SIGMA 1-15P離心機 德國Sigma公司；TS-100B恒溫搖床 上海天呈科技有限公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，FT-IR） 美國Thermo公司；FW-4A型壓片機 天津光學儀器廠；Mettler Toledo XS105DU超越型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶樣品溶液的制備

精確稱取不同采收期苦丁茶粉末5.00 g，加入300 mL水，于100 ℃水浴鍋回流提取3 次，每次2.4 h。冷卻，過濾合并濾液，濃縮，揮干，水定容于10 mL容量瓶備用，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品，此時質量濃度為0.5 g/mL的苦丁茶。每個采收期樣品做3 次重復，結果取其平均值。

1.3.2 杯碟法測定苦丁茶樣品溶液對細菌的生長抑制作用

將3 個菌株分別培養至對數生長期，離心，取下層，用無菌生理鹽水調至OD600nm值為0.1。大腸桿菌菌液按照1∶100（V/V）稀釋，吸取50 μL；金黃色葡萄球菌1∶1 000倍稀釋，吸取30 μL；綠膿桿菌1:100 倍稀釋，吸取40 μL。將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板表面，稍干后將3 個牛津杯等距離放置于瓊脂表面，向牛津杯中定量加入200 μL 0.5 g/mL苦丁茶提取液，4 ℃冰箱放置10 h使其擴散，再置于35 ℃恒溫箱培養18～20 h，觀察并測量抑菌圈直徑，每個藥物抑菌實驗重復3 次，結果取其平均值。

1.3.3 苯酚硫酸法測定苦丁茶不同采收期多糖含量

1.3.3.1 葡萄糖標準曲線的制備

精密稱取無水葡萄糖純品，去離子水定容于100 mL容量瓶中，分別吸取葡萄糖溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，去離子水補足至2.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后，480 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2 換算因素的測定

稱取苦丁茶10 g，置圓底燒瓶中，加水300 mL，100 ℃水浴鍋回流提取4 次，每次2.4 h。冷卻，過濾，合并濾液，濃縮至50 mL。95%乙醇沉淀多糖，用乙醚-丙酮-無水乙醇溶劑系統反復沖洗，真空低溫干燥。得苦丁茶粗多糖。

1.3.3.3 苦丁茶多糖含量的計算

精確稱取干燥至恒重的苦丁茶粗多糖3 份，定容于100 mL容量瓶，得原始質量濃度為ρ1、ρ2、ρ3的苦丁茶多糖。取2 mL按照苯酚硫酸法測定其吸光度A1、A2、A3，根據標準曲線將A1、A2、A3換算成苦丁茶多糖換算質量濃度ρ1*、ρ2*、ρ3*，則：

式中：ρ*為標準品中苦丁茶多糖含量。

1.3.3.4 苦丁茶樣品中多糖含量測定

吸取不同采收期提取液10 μL，水稀釋至2 mL，然后按照1.3.3.3節方法測定苦丁茶樣品中多糖含量。

1.3.4 FT-IR法測定

采用濕法拌樣，取1.3.1節制備的不同采收期苦丁茶供試品溶液10 μL，加入200 mg光譜純KBr中攪拌均勻，再置于烘箱中，60 ℃恒溫干燥24 h，備用。壓片成厚度約1 mm的錠片，將錠片放入紅外光譜儀測定，每個片隨機掃3 個不同的點，再取其平均譜圖作為最后的樣品譜圖。實驗測試條件：光譜范圍4 000～400 cm-1；光譜分辨率4 cm-1；掃描次數32 次，平行實驗3 次。紅外實驗室環境保持恒溫恒濕，溫度25 ℃，相對濕度30%，以保證實驗環境的穩定性。

1.3.5 紅外光譜數據處理

采用OMNI E.S.P.51 智能操作軟件進行紅外譜圖數據處理。每個樣品測定前均對背景進行掃描，對得到的紅外光譜進行基線校正和9點S-G平滑濾波，為了盡可能的消除人為因素的影響，還需對光譜數據做歸一化處理，本實驗采用了的歸一化方法為標準正態變量，最后確定峰值和吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同采收期苦丁茶多糖含量及其抗菌活性

由表1可知，苦丁茶多糖含量隨著氣溫回升不斷增加，4月份達到最高，平均達96.6 mg/g，然后呈緩慢下降的趨勢，7—10月之間多糖含量差異不顯著，11月份后，苦丁茶多糖含量顯著降低，并于12月達到全年最低值，只有47.7 mg/g。在一年的不同月份生長期內，苦丁茶提取物對大腸桿菌的抑菌活性1月較大，2、3月份減小，4月顯著增加，并達到全年最高值，之后逐月減小，11月略有增加，12月達到全年最低值；金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌活性與大腸桿菌的抑菌活性類似，4月份最大，之后逐月減小，12月份最低，與苦丁茶多糖含量的變化規律基本一致。對苦丁茶提取物的抗菌活性與多糖含量測定結果進行相關性分析，結果顯示，苦丁茶提取物多糖含量與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性相關系數均大于0.836，與綠膿桿菌抑菌活性相關系數是0.726（表2），表明苦丁茶中的多糖與其抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的能力密切相關，與抗綠膿桿菌的能力有較大的相關性，多糖是苦丁茶主要的抑菌活性成分。

表1 不同采收期苦丁茶提取物多糖含量及其對3種菌的抑菌活性Table 1 Diameters of the inhibition zones of three bacteria when exposed to aqueous extract of Kudingcha harvested in different growth phases

表2 不同采收期苦丁茶提取物多糖含量及紅外光譜特征峰與其抑菌作用的相關性分析

Table 2 Correlation of antibacterial activity with polysaccharide content as well as IR characteristic peaks for aqueous extract of Kudingcha harvested in different growth phases

注：*. P＜0.05水平上顯著相關；**. P＜0.01水平上顯著相關。

2.2 苦丁茶不同采收期紅外光譜分析

由于4 000～2 000 cm-1波數范圍內存在著明顯的H2O和CO2的吸收峰，且在這區域內的吸收峰多為合頻峰，特征性不強。按吸收峰的來源，可以將4 000～400 cm-1的紅外光譜圖大體上分為特征頻率區（4 000～1 300 cm-1）以及指紋區（1 300～400 cm-1）兩個區域。其中特征頻率區中的吸收峰基本是由基團的伸縮振動產生，數目不是很多，但具有很強的特征性，主要用于鑒定官能團。指紋區的情況不同，該區峰多而復雜，沒有強的特征性。當分子結構稍有不同時，該區的吸收就有細微的差異。指紋區對于區別結構類似的化合物很有幫助。故本實驗紅外光譜數據分析時主要采用1 800～400 cm-1區波段。由圖1可知，根據相似相溶原理，水提物中所含物質極性比較大，根據紅外光譜吸收峰的歸屬，1 735 cm-1為羰基吸收峰[12]，1 601 cm-1附近為芳環骨架振動吸收峰[13]，其中1 601 cm-1的芳環為非極性結構，結合相似相容原理的結論推測該物質可能為芳環骨架與強極性物質結合，例如糖基，以苷類形式存在。故1 735、1 601 cm-1表征了苦丁茶水提物中可能含有黃酮苷、皂苷等苷類物質。1 523、1 454、1 392 cm-1是來甲基、亞甲基C—H彎曲振動的結果[14-16]，1 277、1 124 cm-1部分來自C—C伸縮振動的吸收部分來自C—N伸縮振動的吸收[17]。1 083、991 cm-1的強吸收峰是C—O振動的吸收峰[16]，900 cm-1以下的吸收峰則是糖環骨架振動吸收峰[18]。綜上所述，苦丁茶水提物中主要含有多糖類、苷類物質，這與前人研究結果一致[14-16]。

圖1 1－12月苦丁茶水提物的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of aqueous extract of Kudingcha

圖2 1－12月苦丁茶水提物紅外光譜特征峰強度變化趨勢Fig.2 FT-IR characteristic peaks of aqueous extract of Kudingcha

1 735 cm-1為羰基吸收峰，1 523 cm-1為甲基、亞甲基彎曲振動吸收峰[19]，1 277 cm-1為C—C伸縮振動的吸收[20]，也可能有部分來源于C—N伸縮振動吸收[21]，806 cm-1為糖環骨架振動吸收峰[22]，這4 個吸收峰均能指代多糖中的各特征基團，比較圖2與表1中多糖含量的結果可知，這4 個特征峰強度變化的趨勢與苦丁茶水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌活性的變化趨勢基本一致，都是4月為全年最高，而12月為全年最低。其中1 735 cm-1在6—10月變化較小，呈緩緩下降的趨勢，與大腸桿菌的抑菌圈直徑變化趨勢一致。1 523 cm-1在7月有較強減弱趨勢，其余月份變化平緩，這與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑變化趨勢相似。1 277 cm-1在6、8月處于穩定期，但5、7月下降趨勢明顯，這與綠膿桿菌的抑菌圈直徑變化趨勢一致。806 cm-1在5月有下降之后，直到10月變化都不明顯，但與其他峰一致的是4月為全年最高值，12月為全年最低值，這與3 種菌的抑菌圈直徑結果一致。同時1 735、1 523、1 277、806 cm-14 個特征峰也是苦丁茶中苷類成分和多糖成分的特征峰。

通過SPSS17.0軟件對不同采收期紅外特征峰1 735 、1 523、1 277、806 cm-1的峰強度與其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌圈直徑進行雙變量相關分析，結果顯示（表2），806 cm-1特征峰與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑顯著相關，與大腸桿菌抑菌圈直徑低度相關，與綠膿桿菌的抑菌圈直徑沒有相關性。1 277、1 523 cm-1特征峰與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑極顯著正相關，與大腸桿菌中度相關，與綠膿桿菌抑菌圈直徑也具有弱相關性。1 735 cm-1特征峰與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑相關性顯著，與綠膿桿菌抑菌圈直徑的相關性較弱。雙變量相關分析結果表明多糖，或連接有多糖的苷類物質為苦丁茶的抑菌活性成分。

3 結 論

通過不同采收期苦丁茶提取物對3種菌的抑菌圈直徑比較可知，苦丁茶水提物對大腸桿菌的抑菌圈直徑在1、4、8、11月有顯著增長，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在4、9月有顯著增長，對綠膿桿菌的抑菌圈直徑在3、4、8月有顯著增長。雖然3 種菌的抑菌圈直徑全年增長月份不相同，但均為4月份為抑菌圈直徑最高月，且對3種菌的抑菌圈直徑全年最低值均為12月。

苦丁茶抑菌活性成分4月份含量最高，苦丁茶花期為4、5月份，這證明了中藥葉類采收多在植物光合作用旺盛期，開花期采收的合理性。12月溫度低，苦丁茶生長不活躍，植物代謝能力降低，故苦丁茶的抑菌能力為全年最低值。

雖然中藥混合物中各種成分的疊加譜相互之間有干擾，但從總體變化趨勢來看，苦丁茶多糖含量、苦丁茶水提物紅外光譜特征峰強度變化趨勢與苦丁茶對3 種菌抑菌圈直徑的變化趨勢基本一致，苦丁茶中抑菌活性成分可能為苷類成分和多糖，這與前人研究結果一致[10]。

綜上，廣西苦丁茶冬青中抑菌活性成分含量在春季較高，在冬季較低。因此，苦丁茶的最佳采收期應該為春季。本實驗初步揭示了不同生長季節苦丁茶中抑菌活性成分含量的變化規律，結果提示在苦丁茶的利用上，應重視其不同季節所含的成分變化，根據苦丁茶不同有效成分的功效，合理安排采收時間以利于苦丁茶資源開發及臨床應用。

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Dynamic Change in Bioactive Polysaccharides and Antimicrobial Activity of Kudingcha (Ilex kudingcha C. J. Tseng.)

CAI Juan1,2, HUANG Min-tao1,2, HUANG Yun-feng3, LAI Mao-xiang3, HUANG Rong-shao4, LIU Hua-gang5, HUANG Shu-shi1,*
(1. Biophysics Laboratory, Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530007, China; 2. Department of Pharmacy, Ganzhou Health School, Ganzhou 341000, China; 3. Guangxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530022, China; 4. Department of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530004, China; 5. College of Pharmaceutical Sciences, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

Purpose: To investigate the dynamic accumulation pattern of the main antibacterial constituent, polysaccharides in Kudingcha collected at different months. Methods: Kudingcha was subjected to reflux extraction on a hot water bath and the process was repeated for three times. The cylinder plate method was used to measure the antimicrobial capacity. The diameter of inhibition zone was used to determine the optimal harvest time for Kudingcha. The sugar content was determined by the phenol sulfuric acid method. The correlation between polysaccharides and a ntibacterial activity was evaluated. The fingerprint spectra of Kudingcha aqueous extract obtained by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) were studied and the correlation between characteristic peaks and antibacterial activity was evaluated. Results: The polysac char ide content in Kudingcha increased gradually during the first three months, and reached the peak of 96.6 mg/g in April. Then, it declined gradually to the lowest le vel of 47.7 mg/g in December. The greatest diameters of inhibition zone of Escherichia coli, Staphyloccocus aureus Rosenbach, Pseudomonas aeruginosa were observed when exposed to aqueous extract of Kudingcha harvested in April, and the lowest level when exposed to Kudingcha harvested in December. This trend was similar to the observation for polysaccharide content. Conclusion: The content of antibacterial components is at the highest level in Kudingcha harvested in April, and the best harvest period is in April. Glycosides and polysaccharides are antibacterial components in Kudingcha.

Ilex kudingcha C. J. Tseng; harvest period; bioactive polysaccharides; Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR); antibacterial activity

R285.5

A

1002-6630（2014）09-0043-05

10.750 6/spkx1002-6630-201409010

2013-04-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAI01B04）；廣西科學研究與技術開發計劃項目（0992003A-20）

蔡鵑（1988—），女，碩士研究生，主要從事中藥質量控制研究。E-mail：cjlzl123@126.com

*通信作者：黃庶識（1964—），男，研究員，博士，主要從事中藥質量控制研究。E-mail：hshushi@gxas.cn