鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性

馬華威，楊會成，付萬冬，廖妙飛，周宇芳，相興偉，陳 孟，鄭 斌,*

鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性

馬華威1，楊會成2,3，付萬冬2，廖妙飛2，周宇芳2，相興偉2，陳 孟1，鄭 斌2,*

（1.浙江海洋學院海洋科學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316021；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

選取鐵離子還原體系和3 種自由基體系為指標，研究鮟鱇魚皮膠原蛋白肽體外清除自由基效果和抗氧化作用。采用超濾膜分離鮟鱇魚皮膠原蛋白肽組分，篩選出體外清除·OH活性最好的組分，再建立小鼠衰老模型，將分離得到活性最好的組分采用灌胃法，測定小鼠皮膚中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）的含量，研究鮟鱇魚皮膠原蛋白肽體內抗氧化和清除自由基作用。結果表明：鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強的還原能力且對O－2·、DPPH自由基、·OH具有清除效果，質量濃度為10 mg/mL時對·OH、DPPH自由基、O－2·的清除率和對Fe3+的還原能力分別為70.48%、68.78%、42.53%和0.676；分子質量小于2 000 D的鮟鱇皮膠原蛋白肽組分對·OH具有較好的清除效果，IC50為15.7 mg/mL；劑量為100 mg/（kg?d）時，顯著提高了皮膚中SOD、GSH-Px、CAT的活性，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%，且顯著抑制MDA的形成。

鮟鱇魚皮；膠原蛋白肽；抗氧化；丙二醛；羥脯氨酸

在水產品加工過程中，會產生大量的下腳料（包括魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚骨及其殘留魚肉），其質量約占原料魚的30%～55%，不同部位膠原蛋白的含量從20%～50%不等[1-3]。鮟鱇魚（Lophius litulon）屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，分布于北太平洋西部，我國產于東海北部、黃海及渤海[4]。近年來我國鮟鱇魚出口需求旺盛，產量和價格大幅增加，鮟鱇魚出口己成為我國的新興漁業。然而，在鮟鱇魚的加工中，大量魚皮被作為下腳料而廢棄，這不僅污染了環境，也造成了資源的浪費[5]。目前，為了提高鮟鱇魚皮的經濟附加值，已有學者開始研究從鮟鱇魚加工副產物中提取硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、膠原蛋白等。

以水產膠原蛋白或多肽為基料可開發成各種保健品、功能食品、添加劑等，但與哺乳動物膠原蛋白的應用研究相比，水產膠原蛋白的特性及其在醫學、美容護膚、食品、化工及生物材料等方面的應用研究相對較少，限制了其應用范圍[6]。初步研究結果表明，水產膠原蛋白和多肽具有保護胃黏膜、抗潰瘍作用、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、增強骨強度和預防骨質疏松、預防關節炎、促進角膜上皮創傷修復和促進角膜上皮細胞生長等多種生理活性功能[7-9]。

人體內有多種自由基，尤以氧自由基最多[12]。研究證實人體內氧化產生的自由基與人的衰老、癌癥、動脈硬化等許多疾病有關。過多的自由基可損傷機體內生物大分子，影響細胞的正常結構和功能[10-11]。而在食品等復雜體系中，大量的自由基也會嚴重影響體系的穩定性。因此，越來越多的學者將目光投入到海洋天然抗氧化活性物質的研究中，相關研究報道較多，結果也證實多種水產動物中提取的多肽物質具有體內外抗氧化活性，并顯示了較好應用前景[13-21]。但迄今關于鮟鱇魚皮制備多肽及其抗氧化研究的報道還較少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚皮膠原蛋白肽粉末是由本實驗室利用蛋白酶酶解鮟鱇魚皮，再經冷凍干燥制得。昆明種小白鼠，體質量23～25 g，雌雄各半，浙江大學實驗動物中心提供。實驗動物合格證號SCXK（（浙））20030001。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他的試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

80-2B型高速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；UV-2102 C型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；WDD-2型電腦發光測試儀 北京瑞利分析儀器公司；SCM-300型杯式超濾器 中國科學院上海應用物理研究所；AL-104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；手持式快速pH計 意大利Hanna公司；Micct-Q型超純水器 日本Milli-Por公司；海爾冰箱青島海爾股份有限公司；EYELA冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；SK21-4型數顯水浴鍋 天津歐諾儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽抗氧化能力測定

在本研究中選取VC、茶多酚、叔丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisol，BHA）為對照樣品，體外實驗設置的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質量濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/mL。

1.3.1.1 還原能力測定[22]

取一定鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質量濃度的樣品，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL體積分數1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50 ℃保溫20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL和0.5 mL質量分數為0.1%的FeCl3，然后在700 nm波長處比色。

1.3.1.2 清除O－2·的能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[23]，鄰苯三酚在堿性條件下會發生自氧化，生成有色中間產物和超氧陰離子自由基，對自氧化有催化作用。具體操作：取0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.2緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴預熱20 min，加0.1 mL不同質量濃度的樣品，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后在25℃水浴中反應4 min，立即用VC溶液終止反應，測A299nm值。以蒸餾水代替樣品做空白組，按式（1）計算清除率并求得IC50。

式中：A樣品為樣品吸光度；A空白為空白的吸光度。

1.3.1.3 清除DPPH自由基的能力測定

采用DPPH酶標儀法[24]，加不同質量濃度的樣品溶液100 μL和1 mmo1/L的DPPH自由基甲醇溶液100 μL于96 孔酶標板中，振蕩30 s，37 ℃保溫20 min后在517 nm波長處測定。每個樣品平行測定3 次，然后按式（2）計算。

式中：Ap為樣品和1 mmol/mL DPPH自由基反應后的吸光度；Ac為不加DPPH自由基時樣品的吸光度；Amax為加DPPH自由基但不加樣品（以80%甲醇代替樣品）的吸光度。

1.3.1.4 清除·OH的能力測定[25]

取0.025 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液1 mL、40 μg/mL番紅花紅1 mL、供試樣品0.5 mL、3%過氧化氫1 mL（新鮮配制）、0.945 mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ） 1 mL（新鮮配制），混合后在37℃水浴中反應30 min后在520 nm波長處測定吸光度。空白組以0.5 mL蒸餾水代替供試樣品，對照組以1.5 mL蒸餾水代替EDTA-Fe（Ⅱ）和供試樣品，并按式（3）計算清除率。

式中：A樣品、A空白、A對照分別為樣品、空白和對照組的吸光度。

1.3.2 不同分子質量的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的制備

稱取一定量的鮟鱇皮膠原蛋白肽粉末，用超純水溶解后，依次用截留值分子質量為10 000、5 000、2 000 D的超濾膜進行超濾處理，得到分子質量（Mr）范圍為：Mr＞10 000 D，5 000 D＜Mr＜10 000 D，2 000 D＜Mr＜5 000 D等不同組分的多肽，分別測定各組分多肽對?OH的清除率以及蛋白含量，并計算各組分的IC50，凍干保存。

1.3.3 動物實驗

1.3.3.1 實驗動物的處理

昆明種小白鼠40 只，雌雄各一半，按性別、體質量隨機分為模型組、正常組和實驗組（低劑量組和高劑量組），分組后飼養觀察5 d，以便剔除發育不良個體。模型組每天頸背部皮下注射1 000 mg/（kg?d）的D-半乳糖，同時灌胃2 mL生理鹽水（10 mL/（kg?d））。以超濾膜分離的膠原蛋白肽（Mr＜2 000 D）進行給藥灌胃，按體質量分別設為50 mg/（kg?d）（低劑量組）和100 mg/（kg?d）（高劑量組，灌胃量按照0.1 mL/（10g?d），正常組用生理鹽水2.0 mL/d進行連續灌胃30 d，實驗期間，小鼠自由攝食及飲水。

1.3.3.2 實驗樣本采集

小鼠停止灌胃、停食1 d后，取背部皮下組織，剪碎，并加4 ℃預冷的生理鹽水以固液比1∶9（m/V）混合，用組織勻漿機充分研磨，于3 200 r/min，離心15 min，取上清液－20 ℃保存備用。

1.3.3.3 指標測定

皮膚中SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的測定分別按照試劑盒說明進行。羥脯氨酸含量的測定利用ISO3496（E）的比色法測量在130 ℃條件下6 mol/L的HCl水解4 h的待測樣品。

2 結果與分析

2.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化能力

2.1.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的還原能力

圖1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA的還原能力比較Fig.1 Comparison of reducing power of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

由圖1可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對Fe3+的還原能力隨質量濃度的增加而增強。與VC、BHA和茶多酚相比，10 mg/mL相同質量濃度條件下，鮟鱇魚皮膠原蛋白的還原能力介于VC和BHA之間，以VC的還原能力最高，鮟鱇魚皮膠原蛋白的還原能力0.676。

圖 2鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除的能力比較Fig.2 Comparison of superoxide anion radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

2.1.3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其乙醇紫色溶液在517 nm波長處有強烈的吸收。抗氧化劑能使這一吸收現象消失，顏色褪化，因此通過衡量樣品溶液吸光度的變化能夠快速靈敏的評價抗氧化劑的抗氧化能力[27-28]。由圖3可知，各受試樣品清除DPPH自由基的能力均隨其質量濃度的增加而增大，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質量濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基清除率可達68.78%。質量濃度相同時，各抗氧化劑清除DPPH自由基能力大小依次為茶多酚＞VC＞鮟鱇魚皮膠原蛋白肽＞BHA。

圖3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除DPPHDPPH自由基的能力比較Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

2.1.4 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除·OH的能力

圖4 鮟魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除·OH的能力比較Fig.4 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

?OH是需氧生物代謝過程中生成的具有強氧化能力的氧自由基，因此可以用清除?OH能力來反映樣品抗氧化性的強弱[29-30]。由圖4可知，不同抗氧化劑清除?OH的能力均隨質量濃度的增加而增大，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質量濃度為10 mg/mL時，對?OH的清除率達70.48%，明顯高于VC和BHA。此外，不同抗氧化劑在相同質量濃度條件下，清除?OH能力的大小依次為：鮟鱇魚皮膠原蛋白＞茶多酚＞BHA＞VC。由此可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強的清除?OH能力。

2.2 不同分子質量的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的活性

鮟鱇魚皮酶解液經過10 000、5 000、2 000 D超濾膜，對收集到的各組分按1.3.1.4節中?OH清除能力測定，結果見表1。各受試組分均有清除?OH能力，且活性高低與其分子質量大小相關，隨著分子質量減小而增大，2 000 D以下的活性最高，其IC50達到15.7 mg/mL。因此對2 000 D以下的酶解液組分進行收集并凍干保存，用于抗氧化活性的進一步研究。

表1 超濾分離及清除·OH活性測定結果Table 1 Hydroxyl radical scavenging activity of ultrafiltration fractions

2.3 鮟鱇皮膠原蛋白肽抗氧化活性動物實驗

以清除?OH活性最強的鮟鱇皮膠原蛋白肽（Mr＜2 000 D）進行動物實驗，對小鼠血清及皮膚中各項生化指標進行檢測，結果如表2所示。頸背部皮下注射100 mg/（kg?d）D-半乳糖后的模型組動物體內的自由基大量增加，此時，抗氧化酶體系嚴重破壞，致使SOD、GSH-Px、CAT的活力降低，Hyp水平減少，MDA含量增多，說明致動物衰老模型構建成功。

MDA的形成常用于表示脂質過氧化作用的指數，Hyp的含量是衡量機體對自由基攻擊反應的指數。

表 2 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對小鼠皮膚的抗氧化指標影響（x±s，n=20)Table 2 Effects of collagen peptides in skin antioxidant parameters in mice (x±s，n=20)

由表2可知，模型組小鼠脂質過氧化產物增加，皮膚中Hyp含量顯著降低（P＜0.01）。鮟鱇魚皮膠原蛋白肽可以極大提高皮膚中SOD、GSH-Px、CAT活性（P＜0.05，P＜0.01）。鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量100 mg/（kg?d）時，小鼠皮膚中各抗氧化酶的活力最高，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%。鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量50 mg/（kg?d）時，皮膚中的MDA含量降低（P＜0.05），并對皮膚中的GSH水平沒有影響（P＞0.05）。因此，不同劑量的鮟鱇魚皮膠原蛋白均能顯著增加GSH水平，降低MDA水平，且劑量為100 mg/（kg?d），能顯著抑制MDA的形成，并增加皮膚組織的GSH水平（P＜0.01）。

3 結 論

3.2 小于2 000 D膠原蛋白肽組分對·OH具有較好的清除效果，其IC50為15.7 mg/mL。

3.3 動物實驗結果表明，鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量100 mg/（kg?d）時，皮膚中抗氧化酶的活力最高，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%，顯著抑制MDA的形成。

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Antioxidant Activity of Collagen Peptides from Lophius litulon Skin

MA Hua-wei1, YANG Hui-cheng2,3, FU Wan-dong2, LIAO Miao-fei2, ZHOU Yu-fang2, XIANG Xing-wei2, CHEN Meng1, ZHENG Bin2,*
(1. School of Marine Science, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316021, China; 3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A ferric ion-reducing system and three free radical systems were used to evaluate the radical-scavenging capacity and antioxidant activity of collagen peptides from Lophius litulon skin in vitro. The peptide components were separated by ultrafiltration and the fraction with the highest hydroxyl radical scavenging activity in vitro was obtained. In addition, aged mouse models were constructed and determined for SOD, CAT, GSH-Px, MDA and Hyp contents in the skin after oral administration of the screened fraction. The results showed that Lophius litulon skin collagen peptides had strong reducing power and superoxide anion, DPPH and hydroxyl radical scavenging capacity in vitro. When the sample concentration was 10 mg/mL, the scavenging rates of hydroxyl, DPPH and superoxide anion radicals and the ferric ion reducing power were 70.48%, 68.78%, 42.53% and 0.676, respectively. The fraction with relative molecular weight less than 2 000 D had stronger hydroxyl radical scavenging activity, and its IC50was 15.7 mg/mL. The activities of SOD, GSH-Px and CAT in skin were increased by respectively 20.9%, 41.3% and 58.1% at the dose of 100 mg/(kg·d) when compared with the model group. Moreover the generation of MDA was significantly inhibited.

Lophius litulon skin; collagen peptide; antioxidant activity; malondialdehyde; hydroxyproline

Q936.16

A

1002-6630（2014）09-0080-05

10.7506/spkx1002-6630-201409017

2013-05-07

浙江省廳市會商項目（2011C02003）；舟山市海洋類項目（2011C21059）；浙江省公益技術研究農業項目（2012C22068）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B05-02）

馬華威（1986—），男，碩士研究生，研究方向為海洋生物資源開發與利用。E-mail：ma463543285@163.com

*通信作者：鄭斌（1968—），男，研究員，碩士，研究方向為水產品加工及質量安全控制。E-mail：6369958@163.com