蘆蒿秸稈黃酮類化合物對晚期蛋白質糖基化終末產物形成的抑制作用

鄧榮華，陸 敏，夏秋琴，李曉明，孔陽輝，呂麗爽,*

蘆蒿秸稈黃酮類化合物對晚期蛋白質糖基化終末產物形成的抑制作用

鄧榮華1,2，陸 敏1，夏秋琴1，李曉明1，孔陽輝1，呂麗爽1,*

(1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.青島商務學校，山東 青島 266002)

通過建立牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白質糖基化反應模型，用熒光法測定體外晚期蛋白質糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）的含量，探討蘆蒿秸稈黃酮類化合物對AGEs形成的抑制效果，并對木犀草素的作用途徑進行探索。結果表明：蘆蒿秸稈總黃酮浸膏經AB-8樹脂分離后共收集到4組含有黃酮的洗脫組分（F-10、F-30、F-50、F-70）對AGEs的形成均具有抑制作用，抑制效果由強到弱為依次為F-50＞F-30＞F-10＞F-70，此結果與F-30和F-50分離純化得到的黃酮成分蘆丁和木犀草素具有較好的AGEs抑制效果相一致。同時發現，蘆蒿秸稈對AGEs形成的抑制效果與總黃酮含量存在顯著的線性關系。另外，將木犀草素與MGO的反應產物進行分離純化，高效液相色譜-質譜聯用分析顯示：木犀草素作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加和物來抑制AGEs的形成。蘆蒿秸稈黃酮類化合物可抑制體外蛋白質糖基化反應的活性預示其可以作為AGEs的天然抑制劑來預防和減輕糖尿病及其并發癥。

蘆蒿秸稈；黃酮類化合物；蛋白質糖基化終末產物

晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）是以蛋白質、脂質及核酸的氨基和還原糖為原料，在生理環境中發生非酶催化反應，生成的一類穩定的共價化合物。該反應又稱為Maillard反應或非酶促褐變反應[1]。研究者最初認為AGEs只是蛋白質老化的標志，以便體內識別降解、清除老化的蛋白質[2]。近幾年的研究表明，AGEs與糖尿病并發癥發病機理有關，可以引發神經病變、腎病、視網膜病變、糖尿病以及其他與組織老化相關疾病，如動脈粥樣硬化、老年癡呆癥、慢性腎臟疾病等[3-5]。因此，如何抑制蛋白質的非酶糖基化是近年來國內外研究的熱點。

二羰基化合物，如丙酮醛（methylglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等是還原糖與蛋白質、脂類、DNA發生非酶糖基化反應過程中產生的活性羰基中間體也是AGEs形成的前體物質，并且具有細胞毒性、組織破壞性[6]。二羰基化合物能夠促進蛋白質交聯反應，甚至破壞蛋白組織的結構和功能，在蛋白質糖基化過程中發揮重要作用[7-9]。

蘆蒿（Artemisia selengensis Trucz）是多年生宿根性草本植物，具有藥食兩用性。根據相關文獻報道，蘆蒿具有抗氧化、降血壓、抑菌、抗腫瘤、保護肝臟等生物活性[10-15]。蘆蒿是南京的特色蔬菜，通常廢棄或焚燒其秸稈，為進行蘆蒿秸稈綜合開發，以提高其附加值，本實驗前期已研究了黃酮類化合物的富集純化工藝[16]及其具有的清除自由基活性[17]。而對蘆蒿抑制AGEs形成、減輕和預防糖尿病并發癥的生理功能尚未有文獻報道。本實驗建立了牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albuminmethylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白質糖基化反應模型，探討了蘆蒿秸稈提取物各洗脫組分及黃酮單體對AGEs形成的抑制作用，并分析了木犀草素的作用途徑，為預防糖尿病及其糖尿病并發癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿秸稈采集于南京八卦洲，選擇9月份完全成熟的整株秸稈，洗凈瀝干后，烘至恒質量，粉碎后備用。

BSA 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%丙酮醛 美國Sigma公司；甲醇、乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二甲基亞砜均為分析純。

1.2 儀器與設備

十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilane chemically bonded silica，ODS） 美國Sunchrom公司；硅膠（Silica gel 40，0.2～0.5 mm） 德國Merck公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 美國GE Healthcare公司；制備型厚薄層層析硅膠板 煙臺江友硅膠開發有限公司；高效液相色譜-質譜聯用儀（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）（配有電噴霧離子源（elaectrospray ionization，ESI）） 美國安捷倫公司；Infinite 200Pro TECAN 奧地利Tecan有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆蒿秸稈總黃酮提取及分離純化

取蘆蒿秸稈粉（600 g），用70%乙醇按料液比1∶15（m/V）攪拌浸提2 次，提取溫度90 ℃，提取時間分別為30 min和60 min。合并提取液，于40 ℃減壓濃縮得蘆蒿秸稈提取物濃縮液[19]。石油醚萃取數次去除葉綠素、油脂等雜質，醇沉法除去其中的大部分蛋白質和多糖[20-21]。于45 ℃將濾液旋轉蒸發，回收乙醇，提取物經冷凍干燥備用。

通過對比NKA-Ⅱ、AB-8、HPD417、DM130、D101、HPD826、ADS-17、聚酰胺8種樹脂靜態吸附和解吸性能，篩選出性能最佳的AB-8大孔吸附樹脂作為本實驗樹脂，最優條件參照文獻[16]。將經預處理的蘆蒿秸稈提取物上樣AB-8大孔樹脂，采用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇依次梯度洗脫得到5種不同洗脫組分，將不同體積分數乙醇洗脫組分冷凍干燥分別得到F-10、F-30、F-50、F-70 初步分離組分。

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法進行測定吸光度A[22]，代入標準曲線ρ=0.090 4A－0.000 9（R2=0.999 9）得到總黃酮質量濃度（ρ，mg/mL），并換算為每克干質量樣品中總黃酮的質量（mg）。

將總黃酮含量最高的AB-8洗脫組分（F-30、F-50）分別經ODS柱，硅膠柱分離純化，Sephadex LH-20進一步純化，并結合薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）跟蹤檢測，得到化合物1和化合物2。

1.3.2 高效液相色譜及質譜分析條件

采用HPLC-MS聯用技術對其化合物結構進行分析。

化合物1：采用Agilent1200型高效液相色譜分析。用甲醇溶解樣品，色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱；流動相：A為水-0.01%乙酸、B為乙腈，梯度洗脫：0～10 min（10% B）；10～20 min（10%～60% B）；20～25 min（60% B）。流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；波長：350 nm。DAD檢測器：Scan（200～600 nm）。

化合物2：采用HPLC-ESI-MS分析。用甲醇溶解樣品，色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱；流動相：A為水-0.5%甲酸、B為乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫：0～10 min（12% B），10～30 min（12%～20% B），30～40 min（20%～30% B），40～48 min（30%～60% B），48～49 min（60%～12% B），49～55 min（12% B）。流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；波長：254 nm。

質譜條件：離子源：ESI；負離子檢出模式；噴霧壓力310.28 kPa；干燥器溫度350 ℃；干燥氣流速11 L/min；毛細管溫度為350 ℃，毛細管電壓3.5 kV；分子質量掃描范圍：m/z 100～1 500 u；載氣為高純度氮氣。

1.3.3 體外蛋白糖基化抑制實驗

反應液：BSA 2.8 mg/mL，MGO 1 mmol/L，臨用前用pH 7.4，0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）配制。

蘆蒿秸稈AB-8樹脂梯度洗脫物，用PBS配制成2 mg/mL溶液。將上述反應液1 mL于具塞試管中，分別加入蘆蒿秸稈梯度洗脫物樣品溶液1 mL，并將試管密封為樣品組，以PBS溶液代替樣品溶液為空白組。置37 ℃培養箱中孵育7 d，形成糖基化修飾的白蛋白（AGE-BSA）[23]。

將蘆丁和木犀草素標準品，用少量的二甲基亞砜溶解，用pH 7.4 PBS分別配制成0.5、1、2、5 mmol/L。將上述反應液與樣品溶液各1 mL等體積混合，將試管密封為陽性組，置37 ℃培養箱中孵育7 d，形成AGE-BSA。

利用AGE-BSA在激發波長370 nm，發射波長450 nm有特征性吸收光譜，采用熒光光譜分析法測定其形成的AGE-BSA含量。代入下式計算AGEs抑制率。

1.3.4 木犀草素與MGO反應產物的分析

將木犀草素與MGO以物質的量比1∶10與pH 7.4、0.2 mol/L PBS混合，置于37 ℃培養箱中培養48 h，反應產物經Sephadex LH20凝膠分離純化，按照1.3.2節化合物2的HPLC-MS條件對其純化產物進行鑒定。

1.4 統計學分析

使用SPSS StatistiVcs 17.0軟件對數據進行統計學分析。測定結果以x±s表示，顯著性檢驗為t檢驗，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 蘆蒿秸稈AB-8大孔吸附樹脂洗脫組分總黃酮含量

表1 AB-8梯度洗脫物黃酮含量Table 1 Flavonoid contents of fractions eluted from AB-8 resin

如表1所示，F-50組分總黃酮含量最高，達958 mg/g干質量；F-30組分次之，為893 mg/g干質量。F-10、F-70組分總黃酮含量明顯小于F-30和F-50組分。

2.2 蘆蒿秸稈AB-8樹脂梯度洗脫組分對AGEs的抑制作用

圖1 蘆蒿秸稈AB-8梯度洗脫物對AGEs的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of four elution fractions from AB-8 resin on the formation of AGEs

由圖1可知，各梯度洗脫物對AGEs形成的抑制效果存在顯著性差異，抑制效果由強到弱依次為F-50＞F-30＞F-10＞F-70。在BSA-MGO模型中，F-50對AGEs的抑制率達78.84%；F-30對AGEs的抑制率為66.82%。

2.3 蘆蒿秸稈分離組分對AGEs抑制率與總黃酮含量之間的關系

圖2 總黃酮含量與AGEs抑制率的線性關系（BSA-MGO模型）Fig.2 Linear relationship between inhibition of AGE formation and total flavonoid contents in the BSA-MGO model

由表1和圖2可知，總黃酮含量與AGEs抑制率存在一定的線性關系（R2=0.948）。由此可推斷蘆蒿秸稈提取物對AGEs形成的抑制作用與總黃酮含量密切相關。代入方程y=0.076 5x＋4.456 6計算得，蘆蒿秸稈中黃酮類化合物對BSA-MGO模型產生的AGEs半數抑制濃度為IC50=591 mg/g干質量。

2.4 蘆蒿秸稈組分（F-30和F-50）主要成分

鑒于蘆蒿秸稈分離組分F-50和F-30具有高活性抑制AGEs形成的功效，本研究對兩組分進行進一步的分離純化和結構鑒定。

通過對F-30組分進一步分離得到化合物1：黃綠色粉末，溶于氯仿、丙酮、甲醇等有機試劑，不溶于水。HPLC-MS分析結果如圖3所示，保留時間為15.173 min，單峰；ESI-MS m/z609.2 [M－H]－，則化合物1的分子質量為610 D，與蘆丁標準品分析結果一致，由此可判斷化合物1為蘆丁。

圖3 化合物1液相色譜（A）及質譜圖（B）Fig.3 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 1

圖4 化合物2液相色譜（A）及質譜圖（B）Fig.4 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 2

通過對F-50組分進一步分離得到化合物2：淺黃色粉末，溶于乙醇、甲醇溶液，不溶于冷水。HPLC-MS分析結果如圖4所示，出峰保留時間47.325 min，單峰；ESI-MS m/z 285 [M－H]－，則化合物2的分子質量為286 D，與木犀草素標準品的分析數據一致，由此可判斷化合物2為木犀草素。

2.5 蘆丁、木犀草素對AGEs的抑制作用

由圖5可知，木犀草素和蘆丁均能夠顯著抑制AGEs的形成，且抑制效果均隨著濃度的增加而提高。分析數據可知木犀草素在濃度為0.5～2.5 mmol/L之間無顯著性差異，而蘆丁在濃度為0.25～1.0 mmol/L之間差異性顯著。在濃度為2.5 mmol/L時，蘆丁AGEs抑制率達到89%；木犀草素在濃度為1 mmol/L時， AGEs抑制率為81%。在濃度低于1 mmol/L時，木犀草素的抑制效果優于蘆丁，說明木犀草素捕獲MGO的能力強于蘆丁，木犀草素在低濃度下，仍具有較強的捕獲二羰基化合物的能力，可以作為AGEs的天然抑制劑。

圖5 木犀草素和蘆丁對AGEs的抑制作用（BSA-MGO模型）Fig.5 Inhibitory effects of luteolin and rutin on the formation of AGEs in the BSA-MGO model

2.6 木犀草素與MGO作用途徑

圖6 木犀草素與MGO反應產物液相色譜（A）及質譜圖（B）Fig.6 HPLC (A) and mass spectrum (B) of the adduct formed from the reaction between luteolin and MGO

由圖6可知，準離子峰m/z 357[M－H]－，推斷該產物的分子質量為358 D。而木犀草素分子質量為286 D，產物的準離子峰357[M－H]－恰為木犀草素與MGO的加合物[286＋72－H]－，由此推測木犀草素與MGO反應方程式：C15H10O6（木犀草素）＋C3H4O6（MGO）→C18H14O8（加合物）。

木犀草素與MGO反應后，產物為木犀草素與MGO的加合物，表明木犀草素抑制AGEs形成的作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加合物來抑制AGEs的形成，這與國外文獻報道其他黃酮類化合物作用途徑相一致[24-25]，而其具體作用機理有待進一步考證。

3 討 論

近年來，蛋白質糖基化反應作為糖尿病并發癥的發病機理的有力學說已得到醫學生物學界的普遍認可。研究發現[26-29]，二羰基化合物在人體血漿中的濃度為0.3～1.5 μmol/L，而在糖尿病患者體內濃度很高。二羰基化合物能夠促進蛋白質交聯反應，甚至破壞蛋白組織的結構和功能，在蛋白質糖基化過程中發揮重要作用。因此，開發天然AGEs抑制劑，研究其對AGEs形成的抑制效果及作用機理，對探討非酶糖基化機制和預防糖尿病并發癥具有重要意義。

本實驗建立了BSA-MGO的蛋白質糖基化反應模型，結果顯示：蘆蒿秸稈AB-8梯度洗脫物對AGEs的形成均具有較好的抑制作用，抑制效果為F-50＞F-30＞F-10＞F-70，F-50對AGEs的抑制率達78.84%。通過對各組分總黃酮類化合物分析發現：蘆蒿秸稈組分對AGEs形成的抑制效果與總黃酮含量存在較為顯著的線性關系。由此推斷，蘆蒿秸稈提取物中抑制AGEs形成的主要組分為黃酮類化合物。

為探究蘆蒿秸稈中抑制AGEs形成的具體化合物，將黃酮含量最高的AB-8洗脫組分（F-30、F-50）分離得到2 種黃酮單體：蘆丁和木犀草素。實驗結果顯示，二者對AGEs的形成具有低濃度，高活性的抑制效果。木犀草素在濃度為1 mmol/L時，對BSA-MGO形成的AGEs抑制率為81%。將木犀草素與MGO的反應產物進行分離和HPLC-MS分析，發現木犀草素的作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加和物來抑制AGEs的形成。木犀草素因其較強的捕獲二羰基化合物的能力，可以作為AGEs的天然抑制劑。

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Inhibitory Effect of Artemisia selengensis Straw Flavonoids on the Formation of Advanced Glycation End Products (AGEs)

DENG Rong-hua1,2, LU Min1, XIA Qiu-qin1, LI Xiao-ming1, KONG Yang-hui1, Lü Li-shuang1,*
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Qingdao Commerce School, Qingdao 266002, China)

The inhibitory activity of flavonoids from Artemisia selengensis straw against the formation of fluorescent advanced glycation end products (AGEs) was evaluated in a bovine serum albumin-methylglyoxal (BSA-MGO) model. The formation of total AGEs could be generally followed by measuring their characteristic fluorescence at the excitation and emission maxima of 370 and 440 nm, respectively. Results indicated that 4 elution fractions (F-10, F-30, F-50 and F-70) obtained with AB-8 resin from the flavonoid extract of Artemisia selengensis straw revealed significant inhibitory activities against the formation of AGEs in decreasing order: F-50 ＞ F-30 ＞ F-10 ＞ F-70, which was consistent with the inhibitory effects of rutin and luteolin purified from F-30 and F-50 against the formation of AGEs. Meanwhile, the inhibitory activities of elution fractions were found to be linearly correlated with their total flavonoid contents. The adduct formed from the reaction between luteolin and MGO was purified, and LC-MS analysis showed that luteolin might have the potential to inhibit the formation of AGEs by trapping MGO to form a di-MGO conjugated adduct. Our findings showed that the flavonoids from Artemisia selengensis straw could inhibit the formation of AGEs in vitro, implying their potential use as a new inhibitor for preventing and alleviating diabetes and diabetes-related complications.

Artemisia selengensis straw; flavonoid; advanced glycation end products (AGEs)

TS201.2

A

1002-6630（2014）09-0123-05

10.7506/spkx1002-6630-201409025

2013-06-13

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃立項項目（CXLX11_0893；CXLX12_0417）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012850）；江蘇省高校自然科學基金項目（12KJB5500005）；浙江省自然科學基金項目（LY12C15001）

鄧榮華（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食源性功能因子分離及活性。E-mail：lovedrh_123@163.com

*通信作者：呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向為天然產物的分離純化、生物活性及其構效。

E-mail：lishuanglv@126.com