響應面法優化枯草芽孢桿菌產γ-聚谷氨酸發酵工藝

賀楊揚，曾 偉，王青龍，王大蕓，陳桂光，梁智群

響應面法優化枯草芽孢桿菌產γ-聚谷氨酸發酵工藝

賀楊揚，曾 偉，王青龍，王大蕓，陳桂光，梁智群*

（廣西大學生命科學與技術學院，亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

以1株谷氨酸依賴型γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）產生菌Bacillus subtilis GXA-28為研究對象，利用響應面法系統優化其γ-聚谷氨酸發酵培養基成分。通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及Box-Behnken試驗構建響應方程，利用該方程預測得到最優培養基：蔗糖33.65 g/L、酵母膏0.4 g/L、NH4Cl 1.6 g/L、谷氨酸鈉15 g/L、 KH2PO40.4 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、MgSO4·7 H2O 0.1 g/L、MnSO4·H2O 0.04 g/L。利用優化培養基，在40.2℃、160 r/min條件下搖瓶發酵22 h，γ-PGA產量達到16.63 g/L，底物谷氨酸鈉轉化率比優化前提高了20%，達到100%。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢桿菌；響應面分析；發酵培養基

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是自然界中微生物來源的一種強水溶性多聚高分子化合物，它具有良好的生物可降解性、生物相容性、可食用性、低免疫原性、保濕性[1]，對人體和環境無毒無公害，可廣泛應用于工業、農業、食品、醫藥、化妝品等領域[2]。隨著γ-PGA在很多新領域中的應用拓展，其相關研究越來越受到人們的關注，尤其是在γ-PGA產生菌選育、發酵工藝優化及生物合成機理方面[1]。目前由于受到發酵工藝條件、生產成本及菌株生產能力等限制，國內尚未見大規模工業化生產的相關報道。

γ-PGA最早由Ivanovics等于1937年在炭疽芽孢桿菌莢膜中發現[1]。1942年Bovarnick等[3]首次發現枯草芽孢桿菌能夠分泌胞外γ-PGA，隨后發現短小芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌等也能分泌胞外γ-PGA。目前日本等國家已經采用發酵法實現了γ-PGA工業化生產，產量在25～50 g/L[4]。國內相關課題組報道γ-PGA實驗室發酵產量約30～40 g/L，底物轉化率約70%。發酵過程中由于發酵液黏度較高，嚴重影響其溶氧水平，進而影響菌體生長和γ-PGA產量。因此，建立完善的、系統的、大規模的生產γ-PGA的工藝是今后國內亟待解決的課題之一。

本實驗利用1株耐高溫谷氨酸依賴型菌株Bacillus subtilis GXA-28[5]為研究對象，以優化其發酵培養基成分為目標，采用Plackett-Burman（PB）試驗[6]篩選出顯著影響γ-PGA產量的因素，爬坡試驗確定顯著因子中心值，Box-Behnken設計[7]構建響應方程，利用該方程預測得到最優培養基。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室自主篩選枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GXA-28，菌株保藏編號CCTCC M2012347。

1.2 培養基

種子培養基（g/L）：葡萄糖10、酵母膏5、谷氨酸鈉5、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1， pH 6.5。

斜面培養基成分同種子培養基，加瓊脂粉15 g/L，pH 6.5。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖30、酵母膏2.5、谷氨酸鈉20、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1，pH 6.5。

1.3 培養方法

種子培養：取1 環斜面菌種接于種子培養基中，42 ℃、160 r/min，恒溫振蕩培養16 h。

發酵培養：按2%接種量吸取種子液接于發酵培養基中，42 ℃、160 r/min，恒溫振蕩培養22 h。

1.4 測定方法

發酵液中γ-PGA質量濃度測定：參照文獻[8]。

pH值測定：采用梅特勒-托利多320酸度計測定。

菌體量測定：發酵液經蒸餾水稀釋10倍，660 nm波長處測定吸光度。

殘糖測定：采用二硝基水楊酸法[9]。

1.5 發酵條件優化

1.5.1 單因素試驗

檢測微生物培養基中的營養成分對菌體的生長和產物的積累的影響，主要有碳源、氮源、谷氨酸鈉、金屬離子等。本試驗選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、檸檬酸、木糖、甘油、白砂糖、可溶性淀粉作為碳源，得到最佳碳源后對其進行質量濃度優化，選取梯度為：10、20、30、40、50、60、70 g/L。選取8 種有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、干酪素、玉米粉、黃豆粉和8種無機氮源：NaNO3、KNO3、NH4Cl、(NH4)2CO3、NH4NO3、NH4HCO3、(NH4)2SO4、尿素。得到最佳氮源后對其質量濃度進行優化，選取梯度依次為：2.5、5、7.5、10、20、30、40 g/L。對底物谷氨酸鈉進行優化，選取梯度依次為：10、20、30、40、50、60、70 g/L。通過比較MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、(NH4)6MoO24·H2O對γ-PGA產量的影響，選出影響最顯著的金屬離子。同時發酵條件，如溫度、轉速、裝液量、pH值等對γ-PGA產量也有一定影響。將溫度依次設為：32、34、36、38、40、42、44、46 ℃。轉速依次設為：120、140、160、180、200、220 r/min。裝液量依次設為：25、50、75、100 mL（250 mL三角瓶）。pH值梯度為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。將各種影響因素在基礎發酵培養基的條件上逐一改變，確定每個因素的最佳范圍。

1.5.2 PB試驗設計

通過單因素試驗選出8 個因素：葡萄糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸鈉、MgSO4·7 H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、溫度，依次設計為A、B、C、D、E、F、G、H。每個因素2 個水平，高水平（＋）和低水平（－）。

1.5.3 最陡爬坡試驗

根據PB設計試驗結果選出3 個最顯著影響 γ-PGA產量的因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和溫度，根據其正負效應設定步長及變化方向，快速逼近最佳響應面區域，其他因素均取低水平。

1.5.4 Box-Behnken設計

運用Box-Behnken中心組合設計原理，以最陡爬坡試驗得到的中心點對3 個顯著因素進行Box-Behnken設計，各取3 個水平，高水平（＋）、中間水平（0）和低水平（－）。根據Design-Expert 8.0軟件設計三因素三水平共17 組試驗進行響應面分析。17 組試驗分為兩類：一類是析因點，共12 個；一類是零點，為區域的中心點。零點重復5 次，用于估計實驗誤差。

統計學分析每個變量之間的作用以及它們的交互作用，采用下列二次方程進行產量預測。

式中：Y表示響應值，即γ-PGA產量；Xi和Xj表示獨立變量；β0為一個固定常數；βi、βii和βij分別表示線性相關系數、平方系數和交互系數。

2 結果與分析

2.1 單因素優化

在單因素試驗中，通過比較10 種碳源對γ-PGA產量的影響，選出了最佳碳源為蔗糖，其最適質量濃度為30 g/L。選擇8 種有機氮源和8 種無機氮源進行實驗，得到最佳有機氮源為酵母膏，最佳無機氮源為NH4Cl，其最適質量濃度均為2.5 g/L。由于有機氮源成本較高，所以將無機氮源NH4Cl替代部分有機氮源，在不影響產量的情況下得到兩者的最佳質量配比為1∶4。本實驗所用GXA-28是1 株谷氨酸依賴型菌株，底物質量濃度對γ-PGA產量有很 大的影響，經過實驗確定最佳底物質量濃度為20 g/L。通過比較不同金屬離子對γ-PGA產量的影響，結果表明MgSO4·7H2O和KH2PO4在GXA-28發酵產γ-PGA中是必需的，添加0.1 g/L MnSO4·H2O、0.1 g/L CaCl2和2 g/L K2HPO4·3H2O對其產量有促進，而低質量濃度的FeSO4·7H2O、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O和(NH4)6MoO24·H2O對γ-PGA產量均有抑制作用。

2.2 PB試驗設計

由于Ca2+與SO42-容易形成微溶物，所以在PB設計中將不選用CaCl2。PB試驗結果和方差分析如表1、2所示。

表1 PB試驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

表2 PB試驗設計的效應評價Table 2 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

“Prob＞F”小于0.05，說明該因素是顯著的，模型 Prob＞F小于0.05，說明實驗模型是顯著的。A、B、C、E、F和H是正影響，D和G是負影響。本實驗選擇“Prob>F”小于0.05的3個因素A、G、H（即蔗糖、K2HPO4·3H2O、溫度）為顯著因素。

2.3 最陡爬坡試驗

由PB設計結果可知，蔗糖和溫度是正影響，K2HPO4·3H2O 是負影響，爬坡方向及步長根據其正負性確定，如表3所示。結果表明，γ-PGA最大產量出現在試驗組2。但考慮到Box-Behnken試驗設計的可操作性，蔗糖和溫度的中心點確定為32.5 g/L和43 ℃，K2HPO4·3H2O的中心點確定為1.5 g/L。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Steepest ascent experimental design and results

2.4 Box-Behnken試驗設計

表4 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 4 Box-Behnken design and results

對Box-Behnken試驗設計及結果如表4所示，對結果進行回歸分析，得到如下方程：Y1＝15.31－0.054A＋0.86B－4.27C＋1.99AB－ 0.40AC－0.022BC－2.84A2－2.94B2－3.79 C2。相關系數R2＝0.918 4，說明方程的擬合度很好，可以用該方程進行實驗結果預測。

根據表5方差分析數據可知，二次項對響應值的影響是十分顯著的，交互項的影響不顯著。模型的F值0.004 6遠小于0.05，說明該模型是顯著的。一般認為，相關系數R2大于0.9說明預測值能與實驗值有較高的相關度。本實驗中R2為0.918 4，說明僅有大概8%的γ-PGA產量不能由該模型預測。回歸方程表明蔗糖33.64 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、溫度40.18℃時，γ-PGA產量預測值可達16.67 g/L。對預測結果進行4次重復實驗，得到γ-PGA產量平均值為16.63 g/L，實驗值與預測值擬合度高，說明回歸方程能夠比較真實的預測各因素對γ-PGA產量的影響。

表5 Box-Behnken試驗方差分析Table 5 Analysis of variance for the experimental results of Box-Behnken design

回歸方程作出的響應面圖及等高線圖如圖1所示。等高線圖可直觀反映各因素之間的交互作用強弱，橢圓表示兩因素交互作用明顯，圓形則表示交互作用較小或沒有交互作用。

圖1 溫度、蔗糖和K2HPO4·3H2O添加量對γ-PGA產量的影響Fig.1 Effects of sucrose, temperature and K2HPO4·3H2O on the yield of γ-PGA

2.5 B. subtilis GXA-28發酵過程曲線

圖2 2 B. subtilis GXA-28發酵過程曲線Fig.2 Fermentation profiles of B. subtilis GXA-28

發酵過程中，pH值、菌體量、γ-PGA產量及殘糖量如圖2所示。菌體生長延滯期較短，4 h后即進入對數生長期；16～28 h處于穩定期；30 h后菌體量急速減少，這可能是由于培養基中營養消耗殆盡引起菌體自溶導致的。殘糖量在30 h后處于一個穩定的低水平也說明了這一點。γ-PGA合成和菌體生長呈典型偶聯型，22 h達到最大值；30 h后開始出現降解，這是由于菌體生長后期分泌γ-PGA降解酶引起的。葡萄糖作為速效碳源，在菌體對數生長期被快速利用，20 h即達到一個較低水平。pH值在整個發酵過程中變化不大，35 h后略有上升。

3 結 論

利用PB設計對蔗糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸鈉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、溫度8 個因素進行了二水平12 次試驗，從中選出了3 個主要影響因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和溫度。通過最陡爬坡試驗確定了中心點，進一步用Box-Behnken設計對主要因素進行三因素三水平的17次試驗，確定3 個主要因素的最優值，構建響應方程預測γ-PGA最高產量為16.67 g/L。將得到的最優發酵培養基進行4 次驗證實驗，γ-PGA平均產量為16.63 g/L，實驗值與預測值擬合度高，說明響應方程能夠比較真實地預測各因素對γ-PGA產量的影響。

近年來，國內外關于γ-PGA優化發酵工藝優化的研究十分活躍。Kubota等[4]利用B. subtilis F-2-01發酵制備γ-PGA，其產量可達到50 g/L，底物轉化率為71.43%，該菌株發酵工藝被日本明治公司成功用于工業化生產制備γ-PGA。B. subtilis IFO 3335[10]和B. licheniformis ATCC9945A[11]作為γ-PGA合成代謝途徑以及合成酶相關基因研究的模式菌株，其γ-PGA產量分別達到20 g/L和23 g/L，底物轉化率分別為40%和23%。Bajaj等[12]對B. licheniformis NCIM 2324發酵工藝進行優化后，γ-PGA產量達到26.12 g/L，底物轉化率為41.9%。Shi Feng等[13]對B. subtilis ZJU-7進行優化后，γ-PGA產量為54 g/L，底物轉化率為38.6%。Xu Hong等[14]優化B. subtilis NX-2發酵培養基菌株，得到γ-PGA產量為41 g/L，底物轉化率為41%。Wei Xuetuan等[15]對菌株B. licheniformis WX-02進行優化，其γ-PGA產量為13 g/L，轉化率為35.2%。本實驗所采用的菌株B. subtilis GXA-28，優化后γ-PGA產量達到16.63 g/L，高出優化前20%，優化后底物谷氨酸鈉的轉化率達到了100%，高于上述相關報道γ-PGA底物轉化率30%～60%。

相對于傳統的單因素試驗和正交試驗，響應面法優化發酵培養基的實驗次數少、周期短，不僅能夠對影響因素作出正確的評價，還能夠充分體現幾個主要影響因素的交互作用，從而快速有效地得到最佳條件。目前國內在利用響應面法優化生物反應過程方面、物質提取方面取得良好的結果[16-20]，由此表明采用響應面法優化發酵工藝是提高產量的有效途徑。

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Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions by Response Surface Methodology for the Production of Poly-γ-Glutamic Acid by Bacillus subtilis

HE Yang-yang, ZENG Wei, WANG Qing-long, WANG Da-yun, CHEN Gui-guang, LIANG Zhi-qun*
(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Poly-γ-glutamic acid, as a high molecular polymer produced by microorganism, is widely used in industry, agriculture, food, medicine and cosmetics. This study aimed to use response surface methodology for a systematic optimization of fermentation medium composition for the production of poly-γ-glutamic acid by a glutamic aciddependent strain of Bacillus subtilis GXA-28. A response surface regression equation was established based on the results of one-factor-at-a-time, Plackett-Burman, steepest ascent and Box-Behnken experimental designs. The optimal medium formulation, as predicted from the equation, consisted of 33.65 g/L sucrose, 0.4 g/L yeast extract, 1.6 g/L NH4Cl, 15 g/L monosodium glutamate, 0.4 g/L KH2PO4, 1.68 g/L K2HPO4·3H2O, 0.1 g/L MgSO4·7H2O and 0.04 g/L MnSO4·H2O. The yield of poly-γ-glutamic acid reached 16.63 g/L, which was 20% higher than before the optimization, and the conversion rate of the substrate glutamate reached 100% by using the optimized medium at 40.2 ℃ with shaking at a speed of 160 r/min for 22 h.

poly-γ-glutamic acid; Bacillus subtilis; response surface analysis; fermentation medium

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0147-05

10.7506/spkx1002-6630-201409030

2013-06-23

國家自然科學基金地區科學基金項目（21062001）；廣西研究生教育創新計劃資助項目（YCBZ2012004）

賀楊揚（1989—），女，碩士研究生，研究方向為微生物工程。E-mail：15977108825@163.com

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向為食品生物化學。E-mail：zqliang@gxu.edu.cn