枯草芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的食品級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

沈躍麗，陳 蕊，張 莉，張 充，趙海珍，陸兆新

枯草芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的食品級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

沈躍麗，陳 蕊，張 莉，張 充，趙海珍，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為得到安全可靠的新型生物防腐劑，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵食品同時(shí)提高其抗菌活性。采用單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出4 個(gè)關(guān)鍵因子為脫脂奶粉、番茄汁、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度；使用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)確定出最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件：小麥粉16.0 g/L、脫脂奶粉20.0 g/L、黃豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，裝液量50.0 mL、發(fā)酵溫度32.14 ℃、發(fā)酵時(shí)間60.0 h。擬合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果顯示：優(yōu)化后發(fā)酵液對(duì)熒光假單孢的抑菌圈直徑較優(yōu)化前提高42%，對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑較優(yōu)化前提高47%。

枯草芽孢桿菌；抗菌活性；發(fā)酵；黃豆粉酶解液；優(yōu)化

全世界每年農(nóng)副產(chǎn)品、果蔬等食品及其原料變質(zhì)引起的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大，因此延長(zhǎng)它們的保質(zhì)期是食品工業(yè)的一項(xiàng)重要的任務(wù)[1]，而添加防腐劑是防止食品腐敗變質(zhì)的重要方法之一[2]。目前化學(xué)防腐劑如添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等依然在我國(guó)防腐劑市場(chǎng)上占很大份額，而化學(xué)防腐劑或多或少地對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用。隨著人民生活水平的提高，健康食品、綠色食品的概念已經(jīng)越來(lái)越多的被大眾接受，尋找一種新天然防腐劑以減少化學(xué)防腐劑所造成的潛在的危險(xiǎn)已成為當(dāng)今食品保藏研究的熱點(diǎn)[3]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是自然界中廣泛存在的一種非致病性細(xì)菌，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，主要是一些有機(jī)酸、多肽和前體肽[4]。這些抗菌物質(zhì)對(duì)食品中的多種腐敗菌及致病性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，且易被人、畜體內(nèi)的蛋白酶降解，從而被人體吸收，不會(huì)在體內(nèi)殘留。本課題組在前期研究中得到一株枯草芽孢桿菌PNG27，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有很廣的抑菌譜，對(duì)食品中主要的革蘭氏陽(yáng)性菌（短小芽孢桿菌、藤黃微球菌）、革蘭氏陰性菌（熒光假單胞菌）和霉菌（米曲霉）都有明顯的抑制作用。對(duì)微生物的產(chǎn)生的生物防腐劑的研究已經(jīng)很成熟，且已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)且應(yīng)用范圍非常廣泛，人們將研究的目光逐漸轉(zhuǎn)向用農(nóng)副產(chǎn)品作為原料進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用的研究，而且已經(jīng)取得了一系列的進(jìn)展[5]，這些原料包括乳清粉，以及木薯、土豆等農(nóng)產(chǎn)品的加工副產(chǎn)物[5-9]。但是到目前為止還沒(méi)有人用食品級(jí)的原料來(lái)發(fā)酵產(chǎn)抗菌脂肽，用食品級(jí)的原料發(fā)酵枯草芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)可以做到真正的安全、無(wú)毒副作用，可以作為食品添加劑直接加到食品中應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用單因素試驗(yàn)篩選出最優(yōu)的碳氮源、生長(zhǎng)因子和發(fā)酵條件，然后利用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)[10-12]設(shè)計(jì)法對(duì)影響枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌肽的影響因子進(jìn)行篩選，再利用響應(yīng)面法[13-16]對(duì)篩出的關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得最佳的發(fā)酵工藝來(lái)提高抗菌物質(zhì)的抑菌活性。在抑菌活性提高的基礎(chǔ)上將其抑菌產(chǎn)物用于食品防腐保鮮的研究，其具有良好的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PNG27、短小芽孢桿菌CMCC（B）63202、熒光假單胞菌ATCC49642 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

BPY培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L， pH 7.0。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂18.0 g/L，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌PNG27菌株于37 ℃ NA斜面培養(yǎng)24 h，后以BPY培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，從經(jīng)活化的菌株斜面上轉(zhuǎn)移至BPY培養(yǎng)基中（接種量為兩環(huán)），37 ℃、180 r/min培養(yǎng)11 h，按照4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50 mL/250 mL搖瓶，在33 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2.2 抗菌物質(zhì)的檢測(cè)

枯草芽孢桿菌經(jīng)LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基33 ℃、36 h發(fā)酵，經(jīng)過(guò)5 000 r/min離心20 min去菌體，收集上清，用Ф=0.22 μm的細(xì)菌濾膜過(guò)濾掉菌體，備用。

本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中采用平板擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌效果，即用打孔器將4 層濾紙片制成6 mm的圓紙片，放玻璃平皿內(nèi)包好后于121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌后存干燥處備用，使用前用鑷子將濾紙片壓平。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵濾液對(duì)熒光假單胞菌（G－，37 ℃、24 h）和短小芽孢桿菌（G＋，30 ℃、18 h）的抑菌圈直徑間接反映抗菌物質(zhì)產(chǎn)量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 碳氮源的篩選

將15 g/L的小麥粉、玉米粉、玉米淀粉等替代LB培養(yǎng)基中酵母浸膏進(jìn)行發(fā)酵，并以不添加碳源組作為空白組，胰蛋白胨和NaCl添加量不變。隨后以最優(yōu)碳源為基礎(chǔ)，分別以10 g/L的維維豆奶、脫脂奶粉和200 mL/L堿性蛋白酶水解黃豆粉作為氮源代替胰蛋白胨作為氮源，并以不添加氮源組作為空白組，NaCl添加量不變（因?yàn)樾枰Y選的是食品級(jí)培養(yǎng)基，而LB里的碳源和氮源都不是食品級(jí)，沒(méi)有可比性，所以不添加兩者作為對(duì)照）。

1.2.3.2 生長(zhǎng)因子的篩選

將100 mL/L玉米汁、土豆汁、番茄汁作為生長(zhǎng)因子，以前面優(yōu)化出的培養(yǎng)基作為空白組。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1 不同裝液量的影響

在250 mL三角瓶中裝液量分別設(shè)為50、75、100 mL，發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時(shí)間為36 h以篩選出不同裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響。

1.2.4.2 不同發(fā)酵溫度的影響

以篩選出來(lái)的最適裝液量為基礎(chǔ)，將培養(yǎng)基分別在28、30、33、37 ℃不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為36 h，篩選出不同發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響。

1.2.4.3 不同發(fā)酵時(shí)間的影響

以篩選出來(lái)的最適裝液量和最適發(fā)酵溫度為基礎(chǔ)，將培養(yǎng)基置于24、36、48 h不同發(fā)酵時(shí)間篩選出不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響。

1.2.5 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)前面碳氮源、生長(zhǎng)因子及發(fā)酵條件的篩選，枯草芽孢桿菌PNG27的發(fā)酵培養(yǎng)基的影響因素包括小麥粉、黃豆粉酶解液、脫脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和發(fā)酵條件為裝液量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度[3,17-18]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立都采用軟件Design-Expert（Version8.0.5，Stat-Ease Inc），每組試驗(yàn)3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果中篩選出對(duì)熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌活性顯著的影響因素，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，選擇中心點(diǎn)和各水平的步長(zhǎng)，各水平及代碼。借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析軟件Design-Expert（version8.0.5，Stat-Ease Inc.），每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮源的確定

圖1 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.1 Effect of different carbon sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

枯草芽孢桿菌PNG27是本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌BS1為出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)青霉素鈉的誘變篩選出來(lái)的菌株。如圖1所示，小麥粉、玉米粉、玉米淀粉作為碳源時(shí)都比空白組的抑菌效果好。當(dāng)小麥粉15 g/L為碳源時(shí)，熒光假單胞菌抑菌圈直徑達(dá)到20.41 mm及對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到14.99 mm，比玉米粉和玉米淀粉的效果好。小麥粉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，特別是淀粉，其是小麥粉的主要營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿(mǎn)足菌株所需的碳素營(yíng)養(yǎng)需求，此外小麥粉還含有豐富的氨基酸和礦物和維生素，來(lái)源廣泛、成本低廉。因此選擇小麥粉作為枯草芽孢桿菌PNG27的碳源。

圖2 不同氮源對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

如圖2所示，維維豆奶、脫脂奶粉、黃豆粉酶解液為氮源時(shí)，維維豆奶的抑菌效果不如空白組好，但是脫脂奶粉與黃豆粉酶解液作為氮源時(shí)其抑菌效果都比空白的效果好。當(dāng)脫脂奶粉50 g/L和黃豆粉酶解液[19-20]（即是使用堿性蛋白酶水解黃豆粉將其作為氮源，因?yàn)榇司荒苤苯討?yīng)用黃豆粉）200 mL/L為氮源時(shí)其對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑分別為20.68、19.45 mm及對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為15.97、14.38 mm，抑菌效果較佳，但是考慮到單獨(dú)使用脫脂奶粉作為氮源時(shí)其成本較高，所以使用脫脂奶粉和黃豆粉酶解液作為復(fù)合氮源[21]。黃豆粉酶解液含有豐富的多肽類(lèi)物質(zhì)和氨基酸，脫脂奶粉除了含有豐富的蛋白質(zhì)外還含有豐富的礦物質(zhì)和維生素，兩種營(yíng)養(yǎng)豐富的物質(zhì)互補(bǔ)以滿(mǎn)足菌體不同生長(zhǎng)時(shí)期的需求，降低培養(yǎng)成本。因此以黃豆粉酶解液200 mL/L和脫脂奶粉10 g/L做為復(fù)合氮源，此時(shí)發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到21.12、16.15 mm，比使用單一氮源效果好。

2.2 生長(zhǎng)因子的確定

圖3 不同生長(zhǎng)因子對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.3 Effect of different growth factors for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

生長(zhǎng)因子是一類(lèi)微生物正常代謝必不可少且不能用簡(jiǎn)單的碳源或是氮源自行合成的有機(jī)物。如圖3所示，分別添加土豆汁[22]、番茄汁[23]和玉米汁作為生長(zhǎng)因子，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三者與空白對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑?jīng)]有顯著性區(qū)別，但是番茄汁對(duì)短小芽孢桿菌抑菌圈直徑有所提高。在番茄汁添加量為100 mL/L時(shí)其對(duì)熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到22.33、16.86 mm。番茄汁里含有豐富的VA、VC、VB1、VB2以及胡蘿卜素和豐富的金屬元素鈣、磷、鉀、鎂、鐵、鋅、銅和碘等多種元素，還含有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸、纖維素，所以選番茄汁作為生長(zhǎng)因子，以提高其抗菌活性。

2.3 發(fā)酵條件的確定

2.3.1 裝液量的確定

圖4 通氣量對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of aeration amount on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如圖4所示，裝液量為50 mL時(shí)發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌抑菌圈直徑為22.03 mm及對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.65 mm，比裝液量為75、100 mL的效果好，所以選擇50 mL的裝液量。枯草芽孢桿菌是好養(yǎng)細(xì)菌，低的裝液量使得液體培養(yǎng)基中溶解氧高，滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)和代謝的要求，使得產(chǎn)抗菌物質(zhì)活性提高。

2.3.2 發(fā)酵溫度的確定

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如圖5所示，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌PNG27最適發(fā)酵溫度為33 ℃，此時(shí)發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑為22.16 mm，對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.24 mm，溫度過(guò)高或是過(guò)低都不利于菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以選擇33 ℃為發(fā)酵溫度。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

如圖6所示，培養(yǎng)48 h時(shí)發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑為22.95 mm及對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.94 mm，抑菌活性最好，其與24、36 h的結(jié)果差異顯著。適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有利于抗菌活性的提高，故在下面的響應(yīng)面試驗(yàn)中可以適當(dāng)?shù)陌阎行狞c(diǎn)下移。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of culture time on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

2.4 枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)重要因素的篩選

選用N=15的PB設(shè)計(jì)安排，對(duì)培養(yǎng)基組分：小麥粉、黃豆粉酶解液、脫脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和發(fā)酵條件：裝液量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度共8個(gè)因素進(jìn)行研究，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)確定各因素的水平。各因素及其代碼、編碼水平，其中A～E為培養(yǎng)基組分，F(xiàn)～H為發(fā)酵條件，響應(yīng)值為熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌活性的大小。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果和顯著性檢驗(yàn)如表1～3所示。利用Design-Expert對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析，對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果顯示脫脂奶粉（P＜0.000 1）、番茄汁（P＝0.000 2）、發(fā)酵時(shí)間（P＝0.003 4）、發(fā)酵溫度（P＜0.000 1），小麥粉（P＝0.021 4），它們?cè)讦粒?.05的概率水平上差異顯著，其他因子在此水平上不顯著。以短小芽孢桿菌作為指示菌進(jìn)行方差分析結(jié)果顯示了相似的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。其中脫脂奶粉、番茄汁、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)其產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響都是極顯著的，而小麥粉是有顯著的影響，由于影響因子較多就不考慮將小麥粉作為影響因子進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)[24]。注：*. 該因子效應(yīng)顯著（P＜0.05）；**. 該因子效應(yīng)極顯著（P＜0.01）。下同。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果Table 1 Plackett-Burman experimental design with actual and predicted values of inhibition zone diameter

表2 熒光假單胞菌PB設(shè)計(jì)回歸模型及其顯著性檢驗(yàn)Table 2 Regression coefficients and their significance of Placket-Burman design for the inhibitory activity against Pseudomonas flfl uorescens

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[25-26]，做四因素三水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

利用Design-Expert軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)式方程：

Y1＝－146.43－0.35C＋0.007 5E＋0.40G＋9.76H－0.003 5CE－0.001 9CG＋0.035CH－0.001 1EG＋0.001 4EH＋0.000 54GH－0.013C2＋0.000 50E2－0.002 5G2－0.16H2

Y2＝－147.02－0.24C＋0.073E＋0.44G＋9.32H－0.007 7CE＋0.003 5CG＋0.017CH－0.000 23EG＋0.02EH－0.004 6GH－0.002 4C2＋0.000 075E2－0.002 8G2－0.15H2

式中：Y1為熒光假單胞菌抑菌圈直徑的預(yù)測(cè)值/mm；Y2為短小芽孢桿菌抑菌圈直徑的預(yù)測(cè)值/mm。

從上述結(jié)果來(lái)看，本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型對(duì)熒光假單孢和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑具有高度的顯著性（兩者P＜0.000 1），且其失擬項(xiàng)在α＝0.1水平上均不顯著，其預(yù)測(cè)值（R2＝0.942 5）和試驗(yàn)值（R2＝0.943 1）之間有高度的相關(guān)性。回歸方程顯著性檢驗(yàn)可以看出，G（兩者P＜0.001）、H（兩者P＜0.001）、H2（兩者P＜0.001）對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的曲面效應(yīng)顯著，脫脂奶粉、番茄汁、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度兩兩之間的交互效應(yīng)不顯著，所以響應(yīng)面的圖不在這里展示。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及對(duì)熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌圈直徑的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值Table 4 Box-Behnken experimental design with actual and predicted inhibition zone diameters of Pseudomonas flfl uorescens and Bacillus pumilus

對(duì)于模型方程，采用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得出曲面的極值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件為脫脂奶粉20.0 g/L、番茄汁40.0 mL/L、發(fā)酵時(shí)間60.0 h、發(fā)酵溫度32.14 ℃，此時(shí)熒光假單胞菌抑菌圈直徑23.24 mm，短小芽孢桿菌抑菌圈直徑17.70 mm，為了檢測(cè)響應(yīng)面的可靠性，采用上述的條件進(jìn)行了3 次重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出熒光假單孢的抑菌圈直徑為23.08 mm，短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑17.22 mm，與預(yù)測(cè)值都十分相近，說(shuō)明模型方程與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié) 論

微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累會(huì)受到培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的影響。為了獲得安全可靠的新型生物防腐劑，用安全可靠的食品發(fā)酵提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的抗菌物質(zhì)的活性，產(chǎn)品可直接用于食品的防腐保鮮中。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化，然后應(yīng)用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)諸多影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的因子進(jìn)性評(píng)價(jià)，篩選出重要的影響因子，省時(shí)省力，快速有效。

在PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，獲得影響枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)抗菌物質(zhì)的擬合數(shù)學(xué)模型，獲得適合枯草芽孢桿菌PNG27的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件：小麥粉15.0 g/L、脫脂奶粉20.0 g/L、黃豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，裝液量50.0 mL、發(fā)酵溫度32.14 ℃、發(fā)酵時(shí)間60.0 h。在此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑比優(yōu)化前的16.25 mm提高了42%，對(duì)短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑比優(yōu)化前的11.71 mm提高了47%。

與傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑相比，微生物防腐劑以安全、天然、無(wú)毒副作用的特點(diǎn)而備受人們關(guān)注，用微生物防腐劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)防腐劑已成為食品保藏技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[27]。但是目前我國(guó)明確批準(zhǔn)可以使用的生物防腐劑只有納他霉素和乳酸鏈球菌素，品種單一，因此加快新型生物防腐劑的開(kāi)發(fā)和研究是亟需解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)以食品級(jí)物質(zhì)作為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基原料進(jìn)行研究，為生產(chǎn)食品級(jí)的抗菌物質(zhì)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具有良好的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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Optimization of Food-Grade Medium for the Production of Antibacterial Substances by Bacillus subtilis PNG27

SHEN Yue-li, CHEN Rui, ZHANG Li, ZHANG Chong, ZHAO Hai-zhen, LU Zhao-xin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to obtain safe and reliable new biological preservatives, Bacillus subtilis PNG27 fermented food was used to improve its antibacterial activity. Skim milk powder and tomato juice as well as incubation temperature and time were identified as key medium components and fermentation conditions by one-factor-at-a-time and Plackett-Burman experimental designs. A Box-Behnken response surface methodology was used to determine the optimal medium composition and fermentation conditions as 16.0 g/L wheat flour, 20.0 g/L skim milk powder, 200.0 mL/L soybean meal hydrolysate, 40.0 mL/L tomato juice, 10.0 g/L NaCl, 50.0 mL of medium in a 250-mL triangular flask, and incubation at 32.14 ℃ for 60.0 h. The maximum model-predicted diameter of the inhibition zone of the fermented broth under the optimized conditions was increased by 42% for Pseudomonas fl uorescens and by 47% for Bacillus pumilus compared with those observed before the optimization.

B. subtilis; antibacterial activity; fermentation; soybean flour hydrolysate; optimization

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0168-06

10.7506/spkx1002-6630-201409034

2013-05-15

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B05）

沈躍麗（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：2011108027@njau.edu.cn

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槊腹こ毯褪称飞锛夹g(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn