枯草芽孢桿菌生產抗菌物質的食品級發酵培養基優化

沈躍麗，陳 蕊，張 莉，張 充，趙海珍，陸兆新

枯草芽孢桿菌生產抗菌物質的食品級發酵培養基優化

沈躍麗，陳 蕊，張 莉，張 充，趙海珍，陸兆新*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為得到安全可靠的新型生物防腐劑，用枯草芽孢桿菌發酵食品同時提高其抗菌活性。采用單因素試驗和Plackett-Burman試驗設計篩選出4 個關鍵因子為脫脂奶粉、番茄汁、發酵時間和發酵溫度；使用Box-Behnken原理設計進行響應面試驗確定出最佳培養基配方和發酵條件：小麥粉16.0 g/L、脫脂奶粉20.0 g/L、黃豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，裝液量50.0 mL、發酵溫度32.14 ℃、發酵時間60.0 h。擬合實驗模型結果顯示：優化后發酵液對熒光假單孢的抑菌圈直徑較優化前提高42%，對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑較優化前提高47%。

枯草芽孢桿菌；抗菌活性；發酵；黃豆粉酶解液；優化

全世界每年農副產品、果蔬等食品及其原料變質引起的經濟損失十分巨大，因此延長它們的保質期是食品工業的一項重要的任務[1]，而添加防腐劑是防止食品腐敗變質的重要方法之一[2]。目前化學防腐劑如添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等依然在我國防腐劑市場上占很大份額，而化學防腐劑或多或少地對人體會產生一定的毒副作用。隨著人民生活水平的提高，健康食品、綠色食品的概念已經越來越多的被大眾接受，尋找一種新天然防腐劑以減少化學防腐劑所造成的潛在的危險已成為當今食品保藏研究的熱點[3]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是自然界中廣泛存在的一種非致病性細菌，在生長代謝過程中能夠產生多種抗菌物質，主要是一些有機酸、多肽和前體肽[4]。這些抗菌物質對食品中的多種腐敗菌及致病性細菌有較強的抑制和殺滅作用，且易被人、畜體內的蛋白酶降解，從而被人體吸收，不會在體內殘留。本課題組在前期研究中得到一株枯草芽孢桿菌PNG27，其產生的抗菌物質具有很廣的抑菌譜，對食品中主要的革蘭氏陽性菌（短小芽孢桿菌、藤黃微球菌）、革蘭氏陰性菌（熒光假單胞菌）和霉菌（米曲霉）都有明顯的抑制作用。對微生物的產生的生物防腐劑的研究已經很成熟，且已經工業化生產且應用范圍非常廣泛，人們將研究的目光逐漸轉向用農副產品作為原料進行生產應用的研究，而且已經取得了一系列的進展[5]，這些原料包括乳清粉，以及木薯、土豆等農產品的加工副產物[5-9]。但是到目前為止還沒有人用食品級的原料來發酵產抗菌脂肽，用食品級的原料發酵枯草芽孢桿菌產抗菌物質可以做到真正的安全、無毒副作用，可以作為食品添加劑直接加到食品中應用。

本實驗旨在利用單因素試驗篩選出最優的碳氮源、生長因子和發酵條件，然后利用Plackett-Burman（PB）試驗[10-12]設計法對影響枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌肽的影響因子進行篩選，再利用響應面法[13-16]對篩出的關鍵因子進行優化，從而獲得最佳的發酵工藝來提高抗菌物質的抑菌活性。在抑菌活性提高的基礎上將其抑菌產物用于食品防腐保鮮的研究，其具有良好的應用前景和開發價值。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PNG27、短小芽孢桿菌CMCC（B）63202、熒光假單胞菌ATCC49642 本實驗室保存。

1.1.2 培養基

BPY培養基：牛肉浸膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L， pH 7.0。

NA培養基：牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂18.0 g/L，pH 7.0。

LB培養基：酵母浸膏5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養

將枯草芽孢桿菌PNG27菌株于37 ℃ NA斜面培養24 h，后以BPY培養基作為種子培養基，從經活化的菌株斜面上轉移至BPY培養基中（接種量為兩環），37 ℃、180 r/min培養11 h，按照4%的接種量接入發酵培養基中，裝液量50 mL/250 mL搖瓶，在33 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養36 h。

1.2.2 抗菌物質的檢測

枯草芽孢桿菌經LB基礎培養基33 ℃、36 h發酵，經過5 000 r/min離心20 min去菌體，收集上清，用Ф=0.22 μm的細菌濾膜過濾掉菌體，備用。

本實驗在培養基優化過程中采用平板擴散法檢測抑菌效果，即用打孔器將4 層濾紙片制成6 mm的圓紙片，放玻璃平皿內包好后于121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌后存干燥處備用，使用前用鑷子將濾紙片壓平。通過測定發酵濾液對熒光假單胞菌（G－，37 ℃、24 h）和短小芽孢桿菌（G＋，30 ℃、18 h）的抑菌圈直徑間接反映抗菌物質產量，每個樣品重復3 次。

1.2.3 培養基的優化

1.2.3.1 碳氮源的篩選

將15 g/L的小麥粉、玉米粉、玉米淀粉等替代LB培養基中酵母浸膏進行發酵，并以不添加碳源組作為空白組，胰蛋白胨和NaCl添加量不變。隨后以最優碳源為基礎，分別以10 g/L的維維豆奶、脫脂奶粉和200 mL/L堿性蛋白酶水解黃豆粉作為氮源代替胰蛋白胨作為氮源，并以不添加氮源組作為空白組，NaCl添加量不變（因為需要篩選的是食品級培養基，而LB里的碳源和氮源都不是食品級，沒有可比性，所以不添加兩者作為對照）。

1.2.3.2 生長因子的篩選

將100 mL/L玉米汁、土豆汁、番茄汁作為生長因子，以前面優化出的培養基作為空白組。

1.2.4 發酵條件的優化

1.2.4.1 不同裝液量的影響

在250 mL三角瓶中裝液量分別設為50、75、100 mL，發酵溫度為33 ℃，發酵時間為36 h以篩選出不同裝液量對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響。

1.2.4.2 不同發酵溫度的影響

以篩選出來的最適裝液量為基礎，將培養基分別在28、30、33、37 ℃不同溫度下進行培養，發酵時間為36 h，篩選出不同發酵溫度對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響。

1.2.4.3 不同發酵時間的影響

以篩選出來的最適裝液量和最適發酵溫度為基礎，將培養基置于24、36、48 h不同發酵時間篩選出不同發酵時間對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響。

1.2.5 PB試驗設計

依據前面碳氮源、生長因子及發酵條件的篩選，枯草芽孢桿菌PNG27的發酵培養基的影響因素包括小麥粉、黃豆粉酶解液、脫脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和發酵條件為裝液量、發酵時間和發酵溫度[3,17-18]。試驗設計、數據分析和模型建立都采用軟件Design-Expert（Version8.0.5，Stat-Ease Inc），每組試驗3 次重復，結果取平均值。

1.2.6 Box-Behnken響應面試驗設計

根據PB試驗結果中篩選出對熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌活性顯著的影響因素，結合因素的效應大小和試驗中的實際情況，選擇中心點和各水平的步長，各水平及代碼。借助試驗設計及分析軟件Design-Expert（version8.0.5，Stat-Ease Inc.），每組試驗重復3 次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 碳氮源的確定

圖1 不同碳源對枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.1 Effect of different carbon sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

枯草芽孢桿菌PNG27是本實驗以枯草芽孢桿菌BS1為出發菌株經過青霉素鈉的誘變篩選出來的菌株。如圖1所示，小麥粉、玉米粉、玉米淀粉作為碳源時都比空白組的抑菌效果好。當小麥粉15 g/L為碳源時，熒光假單胞菌抑菌圈直徑達到20.41 mm及對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑達到14.99 mm，比玉米粉和玉米淀粉的效果好。小麥粉中含有豐富的營養，特別是淀粉，其是小麥粉的主要營養成分，能夠滿足菌株所需的碳素營養需求，此外小麥粉還含有豐富的氨基酸和礦物和維生素，來源廣泛、成本低廉。因此選擇小麥粉作為枯草芽孢桿菌PNG27的碳源。

圖2 不同氮源對枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

如圖2所示，維維豆奶、脫脂奶粉、黃豆粉酶解液為氮源時，維維豆奶的抑菌效果不如空白組好，但是脫脂奶粉與黃豆粉酶解液作為氮源時其抑菌效果都比空白的效果好。當脫脂奶粉50 g/L和黃豆粉酶解液[19-20]（即是使用堿性蛋白酶水解黃豆粉將其作為氮源，因為此菌不能直接應用黃豆粉）200 mL/L為氮源時其對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑分別為20.68、19.45 mm及對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為15.97、14.38 mm，抑菌效果較佳，但是考慮到單獨使用脫脂奶粉作為氮源時其成本較高，所以使用脫脂奶粉和黃豆粉酶解液作為復合氮源[21]。黃豆粉酶解液含有豐富的多肽類物質和氨基酸，脫脂奶粉除了含有豐富的蛋白質外還含有豐富的礦物質和維生素，兩種營養豐富的物質互補以滿足菌體不同生長時期的需求，降低培養成本。因此以黃豆粉酶解液200 mL/L和脫脂奶粉10 g/L做為復合氮源，此時發酵液對熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到21.12、16.15 mm，比使用單一氮源效果好。

2.2 生長因子的確定

圖3 不同生長因子對枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果的影響Fig.3 Effect of different growth factors for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

生長因子是一類微生物正常代謝必不可少且不能用簡單的碳源或是氮源自行合成的有機物。如圖3所示，分別添加土豆汁[22]、番茄汁[23]和玉米汁作為生長因子，實驗發現三者與空白對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑沒有顯著性區別，但是番茄汁對短小芽孢桿菌抑菌圈直徑有所提高。在番茄汁添加量為100 mL/L時其對熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到22.33、16.86 mm。番茄汁里含有豐富的VA、VC、VB1、VB2以及胡蘿卜素和豐富的金屬元素鈣、磷、鉀、鎂、鐵、鋅、銅和碘等多種元素，還含有蛋白質、糖類、有機酸、纖維素，所以選番茄汁作為生長因子，以提高其抗菌活性。

2.3 發酵條件的確定

2.3.1 裝液量的確定

圖4 通氣量對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響Fig.4 Effect of aeration amount on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如圖4所示，裝液量為50 mL時發酵液對熒光假單胞菌抑菌圈直徑為22.03 mm及對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.65 mm，比裝液量為75、100 mL的效果好，所以選擇50 mL的裝液量。枯草芽孢桿菌是好養細菌，低的裝液量使得液體培養基中溶解氧高，滿足菌體生長和代謝的要求，使得產抗菌物質活性提高。

2.3.2 發酵溫度的確定

圖5 發酵溫度對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如圖5所示，結果表明枯草芽孢桿菌PNG27最適發酵溫度為33 ℃，此時發酵液對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑為22.16 mm，對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.24 mm，溫度過高或是過低都不利于菌體的生長和代謝產物的產生，所以選擇33 ℃為發酵溫度。

2.3.3 發酵時間的確定

如圖6所示，培養48 h時發酵液對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑為22.95 mm及對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑為16.94 mm，抑菌活性最好，其與24、36 h的結果差異顯著。適當的延長發酵時間有利于抗菌活性的提高，故在下面的響應面試驗中可以適當的把中心點下移。

圖6 發酵時間對枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的影響Fig.6 Effect of culture time on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

2.4 枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質重要因素的篩選

選用N=15的PB設計安排，對培養基組分：小麥粉、黃豆粉酶解液、脫脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和發酵條件：裝液量、發酵時間和發酵溫度共8個因素進行研究，根據前期實驗確定各因素的水平。各因素及其代碼、編碼水平，其中A～E為培養基組分，F～H為發酵條件，響應值為熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌活性的大小。PB試驗設計結果和顯著性檢驗如表1～3所示。利用Design-Expert對其結果進行方差分析，對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑測定結果顯示脫脂奶粉（P＜0.000 1）、番茄汁（P＝0.000 2）、發酵時間（P＝0.003 4）、發酵溫度（P＜0.000 1），小麥粉（P＝0.021 4），它們在α＝0.05的概率水平上差異顯著，其他因子在此水平上不顯著。以短小芽孢桿菌作為指示菌進行方差分析結果顯示了相似的結果，進一步驗證了試驗的準確性。其中脫脂奶粉、番茄汁、發酵時間、發酵溫度對其產抗菌物質的影響都是極顯著的，而小麥粉是有顯著的影響，由于影響因子較多就不考慮將小麥粉作為影響因子進行響應面的設計[24]。注：*. 該因子效應顯著（P＜0.05）；**. 該因子效應極顯著（P＜0.01）。下同。

表1 PB試驗設計及枯草芽孢桿菌PNG27抑菌效果Table 1 Plackett-Burman experimental design with actual and predicted values of inhibition zone diameter

表2 熒光假單胞菌PB設計回歸模型及其顯著性檢驗Table 2 Regression coefficients and their significance of Placket-Burman design for the inhibitory activity against Pseudomonas flfl uorescens

2.5 響應面試驗設計及結果分析

根據PB試驗結果和Box-Behnken的試驗設計原理[25-26]，做四因素三水平的響應面分析，試驗設計及結果如表4所示。

利用Design-Expert軟件對表4中的數據進行回歸分析，得二次多項式方程：

Y1＝－146.43－0.35C＋0.007 5E＋0.40G＋9.76H－0.003 5CE－0.001 9CG＋0.035CH－0.001 1EG＋0.001 4EH＋0.000 54GH－0.013C2＋0.000 50E2－0.002 5G2－0.16H2

Y2＝－147.02－0.24C＋0.073E＋0.44G＋9.32H－0.007 7CE＋0.003 5CG＋0.017CH－0.000 23EG＋0.02EH－0.004 6GH－0.002 4C2＋0.000 075E2－0.002 8G2－0.15H2

式中：Y1為熒光假單胞菌抑菌圈直徑的預測值/mm；Y2為短小芽孢桿菌抑菌圈直徑的預測值/mm。

從上述結果來看，本試驗所選用的二次多項模型對熒光假單孢和短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑具有高度的顯著性（兩者P＜0.000 1），且其失擬項在α＝0.1水平上均不顯著，其預測值（R2＝0.942 5）和試驗值（R2＝0.943 1）之間有高度的相關性。回歸方程顯著性檢驗可以看出，G（兩者P＜0.001）、H（兩者P＜0.001）、H2（兩者P＜0.001）對枯草芽孢桿菌產抗菌物質的曲面效應顯著，脫脂奶粉、番茄汁、發酵時間和發酵溫度兩兩之間的交互效應不顯著，所以響應面的圖不在這里展示。

表4 Box-Behnken設計方案及對熒光假單胞菌和短小芽孢桿菌抑菌圈直徑的實際值和預測值Table 4 Box-Behnken experimental design with actual and predicted inhibition zone diameters of Pseudomonas flfl uorescens and Bacillus pumilus

對于模型方程，采用Design-Expert軟件進行分析，得出曲面的極值點，對應的發酵條件為脫脂奶粉20.0 g/L、番茄汁40.0 mL/L、發酵時間60.0 h、發酵溫度32.14 ℃，此時熒光假單胞菌抑菌圈直徑23.24 mm，短小芽孢桿菌抑菌圈直徑17.70 mm，為了檢測響應面的可靠性，采用上述的條件進行了3 次重復的驗證實驗，得出熒光假單孢的抑菌圈直徑為23.08 mm，短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑17.22 mm，與預測值都十分相近，說明模型方程與實際情況擬合較好。

3 結 論

微生物的生長和代謝產物的積累會受到培養基成分和發酵條件的影響。為了獲得安全可靠的新型生物防腐劑，用安全可靠的食品發酵提高枯草芽孢桿菌生產的抗菌物質的活性，產品可直接用于食品的防腐保鮮中。本實驗在前期對培養基成分和發酵條件的優化，然后應用PB試驗設計對諸多影響枯草芽孢桿菌產抗菌物質的因子進性評價，篩選出重要的影響因子，省時省力，快速有效。

在PB試驗設計的基礎上，通過Box-Behnken設計原理進行響應面優化試驗對主要影響因子進行優化與評價，獲得影響枯草芽孢桿菌PNG27產抗菌物質的擬合數學模型，獲得適合枯草芽孢桿菌PNG27的培養基配方和發酵條件：小麥粉15.0 g/L、脫脂奶粉20.0 g/L、黃豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，裝液量50.0 mL、發酵溫度32.14 ℃、發酵時間60.0 h。在此培養基和發酵條件基礎上，對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑比優化前的16.25 mm提高了42%，對短小芽孢桿菌的抑菌圈直徑比優化前的11.71 mm提高了47%。

與傳統的化學防腐劑相比，微生物防腐劑以安全、天然、無毒副作用的特點而備受人們關注，用微生物防腐劑代替傳統的化學防腐劑已成為食品保藏技術的發展趨勢[27]。但是目前我國明確批準可以使用的生物防腐劑只有納他霉素和乳酸鏈球菌素，品種單一，因此加快新型生物防腐劑的開發和研究是亟需解決的問題。本實驗以食品級物質作為枯草芽孢桿菌培養基原料進行研究，為生產食品級的抗菌物質提供了一定的實驗依據，其具有良好的應用前景和開發價值。

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Optimization of Food-Grade Medium for the Production of Antibacterial Substances by Bacillus subtilis PNG27

SHEN Yue-li, CHEN Rui, ZHANG Li, ZHANG Chong, ZHAO Hai-zhen, LU Zhao-xin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to obtain safe and reliable new biological preservatives, Bacillus subtilis PNG27 fermented food was used to improve its antibacterial activity. Skim milk powder and tomato juice as well as incubation temperature and time were identified as key medium components and fermentation conditions by one-factor-at-a-time and Plackett-Burman experimental designs. A Box-Behnken response surface methodology was used to determine the optimal medium composition and fermentation conditions as 16.0 g/L wheat flour, 20.0 g/L skim milk powder, 200.0 mL/L soybean meal hydrolysate, 40.0 mL/L tomato juice, 10.0 g/L NaCl, 50.0 mL of medium in a 250-mL triangular flask, and incubation at 32.14 ℃ for 60.0 h. The maximum model-predicted diameter of the inhibition zone of the fermented broth under the optimized conditions was increased by 42% for Pseudomonas fl uorescens and by 47% for Bacillus pumilus compared with those observed before the optimization.

B. subtilis; antibacterial activity; fermentation; soybean flour hydrolysate; optimization

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0168-06

10.7506/spkx1002-6630-201409034

2013-05-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B05）

沈躍麗（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：2011108027@njau.edu.cn

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向為酶工程和食品生物技術。E-mail：fmb@njau.edu.cn