脫鹽咸鴨蛋清促鈣吸收肽的制備及脫酰胺修飾

趙寧寧，何 慧，胡 琪，侯 燾，王 馳

脫鹽咸鴨蛋清促鈣吸收肽的制備及脫酰胺修飾

趙寧寧，何 慧*，胡 琪，侯 燾，王 馳

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

為使咸鴨蛋清得到高值化利用，本實驗以電滲析脫鹽的咸鴨蛋清為原料，以可溶性鈣結(jié)合量、水解度為指標，用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃 蛋白酶對脫鹽咸鴨蛋清進行酶解，篩選出最佳實驗用酶為Protamex復(fù)合蛋白酶；進而對制備的蛋清肽進行了脫酰胺處理，分析蛋清肽的氨基酸含量。結(jié)果表明：適合Protamex復(fù)合蛋白酶的酶解條件為加酶量2×104U/g、底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此條件下，水解度為21.97%，所得蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL。再經(jīng)脫酰胺修飾后，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加（P＜0.05）。氨基酸分析顯示蛋清肽中含有較多與鈣結(jié)合 相關(guān)的氨基酸。以脫鹽咸鴨蛋清為原料制備的肽具有較高的鈣結(jié)合活性，脫酰胺修飾可使其鈣結(jié)合能力顯著提升。

脫鹽咸鴨蛋清；酶解；肽；可溶性鈣結(jié)合量；脫酰胺

咸鴨蛋蛋清主要由水和蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)含量約為8.8%～12%，其氨基酸組成與人體需求的接近[1]，是一種全價蛋白；此外還含有10%左右的鹽。咸鴨蛋的消費群主要在東南亞和中國[2]，尤其在中國，無論是總量還是人均消費水平均為世界第一。據(jù)初步估算，每年我國有上百億枚咸鴨蛋黃被用于制作粽子、月餅等食品， 遺留下數(shù)以萬噸計的咸鴨蛋蛋清因含鹽量高達7%～12%，被極大地限制了應(yīng)用范圍[3]。

一直以來，咸鴨蛋 蛋清僅有極少被用于餅干、飼料及面條等的加工制作，近年來也有人用咸蛋清生產(chǎn)咸蛋清粉和一些類似腐乳的產(chǎn)品[4]，或者將咸蛋清直接與魚糜混合以增加魚糜的凝 膠性能[5]，但絕大部分咸蛋清還是遭到丟棄，造成了極大優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費。因此，對咸鴨蛋清進行有效脫鹽，并 使其增值具有良好的應(yīng)用前景。

鈣營養(yǎng)不足是當(dāng)今全球性的健康問題，由于中國人的膳食大量攝入植物性食物，其中的草酸、磷酸和植酸等在腸道中易與攝入的鈣形成不溶性鹽，從而導(dǎo)致鈣的生物利用率降低。研究表明，氨基酸、肽等能和鈣形成可溶性配合物，從而阻止小腸內(nèi)鈣沉淀，更好地促進鈣的吸收。乳制品是值得信賴的、高效的補鈣食品，因為酪蛋白在消化過程中形成的酪蛋白磷酸肽[6]能與鈣形成可溶性的螯合物，有利于鈣的吸收。此后陸續(xù)有卵黃高磷蛋白磷酸肽[7]、大豆肽[8]、魚骨肽[9]、蝦殼肽[10]、乳清蛋白肽[11]等促鈣吸收肽的研究見諸報道。以食品工業(yè)副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)促鈣吸收肽，已成為了一種趨勢。本實驗室也曾報道了雞蛋蛋清肽[12]具有促鈣吸收作用。然而，目前人們對咸鴨蛋蛋清酶解的研究，多數(shù)以獲取較高水解度的肽為目的來制取抗氧化肽[2,13-15]。本實驗以電滲析脫鹽的咸鴨蛋蛋清為原料，以可溶性鈣結(jié)合量為主要指標，結(jié)合水解度，篩選出較佳用酶，制備高活性促鈣吸收鴨蛋清肽，并對其進行脫酰胺修飾以提升其鈣結(jié)合能力，為充分利用咸鴨蛋蛋清資源，提高其附加值，開發(fā)出新的生物利用率高的補鈣產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋蛋清（鹽含量約為70 g/L，蛋白質(zhì)含量約為105 g/L） 湖北神丹健康食品有限公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶 丹麥Novozymes公司；Trypsin胰蛋白酶、Pepsin胃蛋白酶 美國Amresco公司；谷氨酰胺酶 日本天野酶制劑；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

小型實驗用特種電驅(qū)動膜分離器 浙江千秋環(huán)保水處理有限公司；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10 Sartorius標準型pH計 德國賽多利斯公司；TDL-5A臺式低速離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV-102-02WF紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；Laborota4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 脫鹽咸鴨蛋蛋清的制備

參照本實驗室前期研究[16]對咸鴨蛋蛋清進行脫鹽處理：咸鴨蛋蛋清→前處理除雜→稀釋10 倍電滲析脫鹽→超濾濃縮5 倍→冷凍干燥→鴨蛋蛋清粉。

1.3.2 促鈣吸收鴨蛋蛋清肽的制備

1.3.2.1 酶解工藝

鴨蛋蛋清（為脫鹽咸鴨蛋蛋清，下同）→按一定濃度加入蒸餾水→攪拌均勻，沸水浴預(yù)處理40 min→冷卻至所用酶的最適溫度，調(diào)至該酶的最適pH值→加酶→用0.1 mol/L NaOH維持pH值在最適條件，酶解一段時間并記錄NaOH用量→沸水浴滅酶10 min→冷卻，4 000 r/min離心10 min→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→測定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.2.2 蛋白酶的篩選

在Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin、Pepsin各種蛋白酶廠家推薦的最適反應(yīng)條件（表1）下，按底物質(zhì)量濃度40 g/L、酶解時間4 h、加酶量 20 000 U/g進行酶解，以可溶性鈣結(jié)合量和水解度為指標，篩選最佳蛋白酶。

表1 各種蛋白酶最適反應(yīng)條件Table 1 The optimal reaction conditions for the selected proteases

1.3.2.3 復(fù)合蛋白酶酶解鴨蛋蛋清的單因素試驗

以pH值、溫度、加酶量、底物質(zhì)量濃度、 酶解時間為單因素變量，以可溶性鈣結(jié)合量為主要活性指標，水解度為輔助指標，進行單因素試驗，各單因素變量水平如下：50 ℃、底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量2×104U/g、酶解3 h，考察pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的影響；在底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量2×104U/g、酶解3 h、pH 6.5條件下，考察溫度45、50、55、60 ℃影響；在底物質(zhì)量濃度 40 g/L、反應(yīng)3 h、pH 6.5、50 ℃條件下，考察加酶量 5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 U/g的影響；在50 ℃、pH 6.5，加酶量2×104U/g，酶解反應(yīng)3 h的條件下，考察底物質(zhì)量濃度20、30、40、50、60 g/L的影響；在底物質(zhì)量濃度40 g/L、pH 6.5、50 ℃、加酶量2×104U/g條件下，考察酶解時間2、3、4、5、6 h的影響。

1.3.2.4 復(fù)合蛋白酶酶解鴨蛋蛋清的正交試驗

進一步對復(fù)合蛋白酶酶解工藝進行正交優(yōu)化，對同一種酶來說，最適pH值和溫度基本不變，固定pH值和溫度，選擇加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間三因素為變量，設(shè)計三因素三水平正交試驗。

1.3.3 鴨蛋蛋清肽的脫酰胺化

將上述鴨蛋蛋清肽配成20 g/L的溶液，于50 ℃、pH 7.0條件下添加 質(zhì)量分數(shù)5%谷氨酰胺酶，分別在反應(yīng)時間0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時取樣，凍干后測定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.4 鴨蛋蛋清肽氨基酸分析

參照國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸自動分析儀測定鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成。

1.3.5 可溶性鈣結(jié)合量的測定

測定方法參照Sato等[17]的方法，略做改進：將5 mmol/L CaCl2和20 mmol/L pH 7. 8的磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣沉淀，加入一定量的鴨蛋蛋清肽，37 ℃保溫2 h，10 000 r/min離心15 min，取適量上清液采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法[18]測定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.6 水解度的測定

Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin酶解水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定采用pH-stat法[12]，Pepsin酶解水解度的測定采用甲醛滴定法[19]。

采用pH-stat法時，式中：α為α-氨基解離度，α = [10（pH－pK）]/[1＋10（pH－pK）]，其中pK＝7.0，pH為酶解pH值；V為消耗NaOH的體積/mL；c為NaOH的濃度/（mol/L）；mp為底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；htot為每克原料蛋白中肽鍵數(shù)/（mmol/g），對鴨蛋清蛋白而言取11.1 mmol/g。

采用甲醛滴定法時，式中：h為酶解液中－NH2或－COOH的含量/（mmol/g）；h0為原料蛋白中－NH2或－COOH的含量/（mmol/g）。

1.3.7 蛋白酶活力的測定

參 照國標SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。酶活力的定義為：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1 個酶活力單位，以1 U/g（U/mL）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種蛋白酶酶解效果比較

表2 5 種蛋白酶酶解效果比較Table 2 Comparative hydrolysis of duck egg white by diffident proteases

在各種蛋白酶的最適溫度和最適p H值條件下酶解鴨蛋蛋清后，所得酶解液的可溶性鈣結(jié)合量和水解度結(jié)果如表2所示。就酶解液的可溶性鈣結(jié)合量指標而言，以P r o t a m e x酶解液最高，達到15.79 μg/mL，極顯著高于其余4 種酶（P＜0.01）；其次為Pepsin和Trypsin，在3～4 μg/mL之間；最低的為Alcalase 2.4 L， 僅有1.56 μg/mL。就水解度指標而言，Protamex為19.36%，低于Alcalase 2.4 L的20.96% （P＜0.05），但極顯著高于其余3種酶（P＜0.01）。Neutrase 0.8 L酶解物的水解度達到14.24%，其余2 種酶均低于5%。作為促鈣吸收肽，可溶性鈣結(jié)合量是主要指標，綜合考慮Protamex在可溶性鈣結(jié)合量和水解度方面比其余4 種酶存在一定優(yōu)勢，可能是因為其余4種酶屬于內(nèi)切酶，而Protamex是復(fù)合酶，相比而言酶切位點更寬，釋放出的鈣結(jié)合位點更多。因而后續(xù)僅對Protamex酶解條件進行進一步優(yōu)化。

2.2 Protamex酶解鴨蛋蛋清單因素試驗

2.2.1 pH值對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖1 pH值對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.1 Effect of pH on the enzymolysis of duck egg white

反應(yīng)pH值對鴨蛋蛋清酶解效果的影響如圖1所示。pH值在6.0～7.5時，對可溶性鈣結(jié)合量無顯著性影響（P＞0.05），在pH 6.5時其可溶性鈣結(jié)合量稍高，達到26.89 μg/mL；繼續(xù)增大pH值至8.0時，可溶性鈣結(jié)合量顯著降低（P＜0.05），僅為3.5 μg/mL。水解度則隨著pH值的增加先增大后減小，在pH 6.5時達到最大為21.20%，顯著高于其余4 個值（P＜0.05）。這是因為酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到pH值的影響，過酸過堿都會加劇酶蛋白的失活，Protamex為中性酶，在中性條件下酶活力較高。Protamex在pH 6.5時可溶性鈣結(jié)合量和水解度均較高，故選取最佳pH值為6.5，這與廠家推薦的最優(yōu)pH值相一致。

2.2.2 溫度對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

反應(yīng)溫度對酶解效果的影響如圖2所示。由于Protamex最適溫度范圍為50～60 ℃，故選取單因素溫度范圍為45～60 ℃。隨著溫度逐漸升高，可溶性鈣結(jié)合量和水解度也逐漸增強，50～55 ℃達到最大，均顯著高于45 ℃和60 ℃（P＜0.05），之后開始逐漸下降，這是因為酶的活性隨著溫度升高不斷受到抑制。由于50 ℃和55 ℃對兩種指標的影響均不顯著（P＞0.05），考慮到節(jié)能，故選定最佳酶解溫度為50 ℃。

圖2 溫度對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.2 Effect of temperature on the enzymolysis of duck egg white

2.2.3 加酶量對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖3 加酶量對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the enzymolysis of duck egg white

加酶量對酶解效果的影響如圖3所示。隨著酶量的增加，酶解程度不斷增加，當(dāng)加酶量達到2×104U/g后，水解度仍有增加，但整體趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05），說明反應(yīng)所需的酶量接近飽和。然而，酶量的繼續(xù)增加會使可溶性鈣結(jié)合量顯著減小（P＜0.05），說明肽鏈并非越短越好，過度水解會使合適的肽段降解，故宜將加酶量控制在2×104U/g為好。

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖4 底物質(zhì)量濃度對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the enzymolysis of duck egg white

底物質(zhì)量濃度對酶解反應(yīng)的影響如圖4所示。隨著底物質(zhì)量濃度增大，水解度先是緩慢減小，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達到40 g/L后，減小幅度顯著增加（P＜0.05）；可溶性鈣結(jié)合量則是先不斷增大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為40 g/L時，達到最大，之后隨著底物質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，可溶性鈣結(jié)合量顯著減小（P＜0.05）。這可能是因為當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度較低時，酶可與底物充分接觸，因而水解度較高，如前分析過高的水解度并非對提升鈣結(jié)合量有利；實驗顯示隨著底物質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，鴨蛋清的溶解會受到一定影響，酶解過程中很容易形成凝膠狀態(tài)，從而影響酶與底物的充分接觸，同時蛋清蛋白過量也造成了資源浪費，故水解度和可溶性鈣結(jié)合量降低。由此可知，宜將底物質(zhì)量濃度控制在40 g/L時為宜。

2.2.5 酶解時間對酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖5 酶解時間對酶解鴨蛋清蛋白的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the enzymolysis of duck egg white

酶解時間對可溶性鈣結(jié)合量和水解度的影響如圖5所示。在3 h之前，可溶性鈣結(jié)合量顯著升高（P＜0.05），之后隨著時間的延長，可溶性鈣結(jié)合量顯著減小（P＜0.05）后趨于不變；水解度也隨時間的增加迅速升高，反應(yīng)4 h后水解度基本平穩(wěn)（P＞0.05）。其原因可能是隨著酶解的進行，底物蛋白被不斷酶切，許多鈣結(jié)合點位被不斷釋出，故可溶性鈣結(jié)合量增加，之后繼續(xù)酶切會使合適的肽段降解，可溶性鈣結(jié)合量反而降低；由于底物質(zhì)量濃度是一定的，隨著時間延長酶解達到飽和，水解度增大到一定程度后也趨于平緩。因此選擇酶解時間3 h進行后續(xù)實驗。

2.3 Protamex酶解鴨蛋蛋清蛋白正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果與方差分析如表3、4所示。就可溶性鈣結(jié)合量而言，影響其大小的因素順序依次為：B＞A＞C，其最佳酶解工藝條件為A3B1C3；影響水解度大小的順序為：A＞B＞C，其最佳酶解工藝條件與以可溶性鈣結(jié)合量為指標的條件相吻合，亦為A3B1C3。加酶量和底物質(zhì)量濃度對兩指標的影響達到顯著性水平（P＜0.05），酶解時間的影響相對較小。綜上所知，最佳酶解條件為：復(fù)合蛋白酶加酶量2×104U/g、蛋清底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此條件下，酶解水解度為21.97 %，所得鴨蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL（5.84 mg Ca/g肽）。

表3 Protamex酶解鴨蛋蛋清蛋白正交試驗方案及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design scheme with experimental results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 鴨蛋蛋清肽的脫酰胺化

圖6 脫酰胺化對鴨蛋蛋清肽可溶性鈣結(jié)合量的影響Fig.6 Effects of deamination of duck egg white peptides on the amount of soluble calcium-binding peptides

用谷氨酰胺酶對肽段進行脫酰胺處理后，可以使肽段中酰胺類氨基酸（例如谷氨酰胺和天冬酰胺）側(cè)鏈上的酰胺基團轉(zhuǎn)變?yōu)轸然欣谂c鈣離子配位，即羧基增多，配位點位增多，故鈣結(jié)合能力增強。樣品的可溶性鈣結(jié)合量隨著谷氨酰胺酶處理時間的變化曲線如圖6所示，鴨蛋蛋清肽經(jīng)過脫酰胺處理后，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加（P＜0.05），并且隨著谷氨酰胺酶處理時間的延長而不斷增加，在1.5～3.0 h變化不顯著，繼續(xù)延長脫酰胺時間至4 h時，其結(jié)合鈣能力反而有所下降，但此時仍顯著高于未脫酰胺的鴨蛋清肽（P＜0.05）。Jin Donghao等[20]研究發(fā)現(xiàn)脫酰胺后的大豆蛋白酶解物阻止碳酸鈣結(jié)晶形成的能力增強；包小蘭[8]曾報道了脫酰胺后的大豆肽其鈣結(jié)合能力提升；此外，對酪蛋白進行谷氨酰胺酶脫酰胺處理后，也發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物結(jié)合Ca2+、Fe3+的能力增強[21]。本實驗對鴨蛋蛋清肽脫酰胺處理后，旨在進一步提高其鈣結(jié)合能力，本實驗結(jié)果也說明鴨蛋蛋清肽中的羧基尤其是谷氨酸和天冬氨酸殘基側(cè)鏈上的羧基對提高鈣結(jié)合能力有著重要貢獻。

2.5 鴨蛋蛋清肽氨基酸分析結(jié)果

表5 脫鹽咸鴨蛋蛋清蛋白、鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid duck egg white and duck egg white peptides g/100 g

由表5可知，脫鹽咸鴨蛋蛋清蛋白和鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成相差不大，氨基酸總量均在85%左右，酸性氨基酸與堿性氨基酸的含量也基本相似。兩者相比，前者的Cys、Pro、Arg高于后者，后者的Phe、Tyr、Leu和His高于前者。有研究報道[8,10,22-23]，除了磷酸化肽能與鈣有效結(jié)合外，一些非磷酸化肽的酸性氨基酸羧基、堿性氨基酸側(cè)鏈上的氨基氮以及His的咪唑基均是鈣的結(jié)合位點，鴨蛋蛋清肽中這3 類氨基酸總量為38.59%，和大豆肽相似（37.64%[8]）。此外，Ser、Thr、Tyr、Met是目前認為主要能夠被磷酸化的氨基酸[18]，其中Ser、Thr能被磷酸化的概率又高于其余兩種氨基酸。鴨蛋蛋清肽中此類氨基酸總量為24.59%，顯著高于大豆肽（7.75%[8]）。Lee等[24]進行體外研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化后的大豆肽其鈣結(jié)合能力顯著增加，若對鴨蛋蛋清肽進行磷酸化修飾，其鈣結(jié)合量能力有望進一步提升。

3 討論與結(jié)論

目前對于雞蛋蛋清酶解制肽的研究較多，而對鴨蛋蛋清酶解制肽的研究相對較少，且這些研究多以追求較高水解度為目的，因為水解度越高，得到的小肽較易吸收。例如吳暉等[19]以鮮鴨蛋清為原料制備了高水解度的鴨蛋清肽，確定了以堿性蛋白酶-胰蛋白酶組成的雙酶分步水解工藝效果最佳，水解度可達26.6%；王曉玲等[1]直接以咸鴨蛋清為原料，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶質(zhì)量比為4∶6（加酶總量為4 500 U/g pro）時酶解液水解度達到了23.10%；以脫鹽蛋清為底物，采用木瓜蛋白酶酶解獲取的蛋清肽水解度也達到了23.2%[15]。本實驗旨在追求較高的可溶性鈣結(jié)合量，在此前提下，得出以復(fù)合蛋白酶酶解脫鹽咸蛋清最佳，其水解度也達到了21.97%，提示可能促鈣吸收蛋清肽的分子質(zhì)量較小，這也是有利于吸收的。

由蛋清酶解制備的肽，其活性主要涉及抗氧化、降血壓、抗疲勞等。對于促鈣吸收肽而言，高鈣結(jié)合量是其重要指標，而適當(dāng)?shù)乃舛炔拍鼙ＷC較高的鈣結(jié)合率。本實驗室曾對雞蛋蛋清肽的制備研究發(fā)現(xiàn)[12]，單酶酶解雞蛋蛋清時，沒有一種酶能使酶解液中可溶性鈣結(jié)合量和水解度兩項指標同時較高，用Neutrase 0.8 L和Alcalase 2.4 L雙酶復(fù)合酶解雞蛋蛋清后，所得雞蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為21.15 μg/mL，水解度為8.66%；而本實驗發(fā)現(xiàn)Protamex復(fù)合蛋白酶酶解后，酶解液能兼具較高可溶性鈣結(jié)合量和水解度。可能是因為對雞蛋蛋清酶解研究時，采用的5 種酶均為內(nèi)切酶，而Protamex復(fù)合蛋白酶兼具內(nèi)切與外切的功能，酶切位點更寬；鴨蛋蛋清與雞蛋蛋清雖然蛋清蛋白組成有相似性，但畢竟氨基酸組成不同。本實驗采用的是脫鹽咸鴨蛋蛋清，高鹽含量對蛋白的組成稍有影響。此外，有報道[8]采用蛋白酶M酶解大豆蛋白，獲取的大豆肽可溶性鈣結(jié)合量為2.7 mg Ca/g肽，本實驗獲得的鴨蛋蛋清肽，其鈣結(jié)合能力（5.84 mg Ca/g肽）遠高于此大豆肽。

本實驗以脫鹽咸鴨蛋清為原料，確定了Protamex復(fù)合蛋白酶對蛋清蛋白的酶解工藝，獲取了有較高鈣結(jié)合能力的鴨蛋蛋清肽，可以與鈣生成可溶物。最佳酶解工藝為：Protamex復(fù)合蛋白酶加酶量2×104U/g、蛋清底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50℃、pH 6.5、酶解3.5 h。在此條件下，酶解水解度為21.97%，所得鴨蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL（5.84 mg Ca /g肽）。脫酰胺化后的蛋清肽，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加，氨基酸分析結(jié)果也顯示蛋清肽中有較多與鈣結(jié)合相關(guān)的氨基酸。以脫鹽咸鴨蛋清為原料制備的鴨蛋蛋清肽具有較高的鈣結(jié)合活性。

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Preparation and Deamination of Calcium Absorption-Promoting Peptides from Desalted Duck Egg White

ZHAO Ning-ning, HE Hui*, HU Qi, HOU Tao, WANG Chi
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

To prepare high-activity peptides with calcium absorption-promoting function, desalted duck egg white after electro-dialysis was hydrolyzed by one of fi ve enzymes (alcalase 2.4 L, neutrase 0.8 L, protamex, trypsin, and pepsin), and then deamidation and amino acid composition analysis of the peptides were conducted. The results showed that protamex was selected as the optimal enzyme wh en the amou nt of soluble calcium-binding peptide and the degree of hydrolysis (DH) were measured. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: Protamexdosage 20 000 U/g, substrate concentration 30 g/L, temperat ure 50 ℃, pH 6.5, and hydrolysis time 3.5 h. Under these conditions, the DH reached 21.97% and the amount of soluble calcium-binding peptide was 29.22 μg/mL. After deam idation, the amoun t of soluble calciumbinding peptides was increased significant ly (P ＜ 0.05). Amino a cid analysis revealed that a lot of amino acids in the peptides contributed to the calcium-binding capacity. Conclusion: Desalted duck egg white can be used to pro duce highactivity peptides with calcium absorption-promoting functions and deamidation of duck egg white peptides can increase the amount of soluble calcium-binding peptides signifi cantly.

desalted duck egg white; enzymatic hydrolysis; peptides; amount of soluble calcium-binding peptide; deamidation

TS253.9

A

1002-6630（2014）09-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201409036

2013-07-01

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項基金項目（52902-0900205118）

趙寧寧（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：zhao90nn@163.com

*通信作者：何慧（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn