響應面法優化受精蛋蛋清制備抗氧化肽酶解工藝

王俊杰，趙 燕,*，涂勇剛，羅序英，李建科，陳彰毅

響應面法優化受精蛋蛋清制備抗氧化肽酶解工藝

王俊杰1，趙 燕1,*，涂勇剛2，羅序英1，李建科1，陳彰毅1

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045）

以酶解產物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基清除 率為指標，在單因素試驗的基礎上，選擇酶解溫度、pH值、底物質量濃度、加酶量4 個因素，通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析法優化酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的最佳工藝條件。結果表明：在酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g條件下，所得酶解產物的DPPH自由基清除率活性最強，達到84.97%。堿性蛋白酶酶解得到的產物具有較強的抗氧化活性，優化工藝條件與理論預測擬合度高。

受精蛋；抗氧化肽；酶解；響應面

人體新陳代謝過程中會產生一些活性氧和其他自由基產物，這些物質的過量積累會對DNA、蛋白質、膜脂質和碳水化合物等生物大分子產生氧化性損傷[1-3]。據報道，這些物質在一些疾病（癌癥、冠心病、糖尿病、風濕性關節炎、老年癡呆）的發生過程中起著重要作用[4-7]。在食品加工中脂肪氧化導致食品變質，同時可能生成一些具有 潛在毒性的反應產物[8]。雖然市場上有一些合成抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚、二叔丁基對甲酚、叔丁基對二苯酚等，由于這些物質不規范使用或濫用都具有很大的安全隱患[9]，因此在日常的使用中都有嚴格的控制，所以目前迫切需要開發具有天然安全、無毒副作用的抗氧化劑。

從動植物蛋白分離制備生物活性肽是研究熱點，生物活性肽一般由3～20 個氨基酸殘基組成，并且其活性與氨基酸種類和序列有關[10]，這些生物活性肽自身具有營養功能，且具有分子質量小、熱穩定、易吸收的特點。禽蛋含有豐富的蛋白質，易吸收，并且其氨基酸組成與人體需要的必需氨基酸比例類似[11]。目前國內外均是采用酶解的方式從禽蛋蛋白中分離制備抗氧化活性肽，如Tanzadehpanah等[12]用胃蛋白酶酶解鴕鳥蛋蛋清獲得LTEQESGVPVMK，Chen Chen等[13]用采用木瓜蛋白酶酶酶解雞蛋蛋清，獲得兩個抗氧化肽YLGAK（551.54 D）和GGLEPINFQ （974.55 D），Davalos等[14]用胃蛋白酶酶解蛋清獲得4 個抗氧化肽YAEERYPIL、SALAM、YQIGL、YRGGLEPINF。受精蛋是一種在特定的條件下能夠孵化的禽蛋，孵化過程中蛋內的水分、蛋白質、脂肪、無機鹽等營養物質在酶的作用下進行一系列的代謝和轉化[15]，這些物質的變化為制備新型抗氧化肽提供基礎，此外本課題組前期測定了經孵化后的受精蛋蛋清的抗氧化活性，發現經孵化后的受精蛋蛋清抗氧化活性有明顯提高[16]。本實驗研究酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的工藝條件，為下一步制備抗氧化肽提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

三黃雞受精蛋 江西農業大學動物科學技術學院。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；硫酸亞鐵、鄰菲羅啉、鄰二氮菲、乙醇 國藥集團（上海）化學試劑有限公司；堿性蛋白酶（10萬 U/g）上海藍季科技發展有限公司。

752N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；AR1140電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；DKB-501A超級恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；科裕KFU微電腦全自動孵化機 山東省德州 市科裕孵化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 受精蛋的孵化條件

孵化溫度38.2 ℃，相對濕度為60%。

1.2.2 樣品的制備

取孵化6 d的受精蛋蛋清→高速勻漿后冷凍干燥→堿性蛋白酶酶解→滅酶（95 ℃、10 min）→5 000 r/min 離心15 min→收集上清液即為抗氧化肽。

1.2.3 單因素試驗

以酶解液的DPPH自由基清除能力為指標，分別 考察底物質量濃度、加酶量、pH值、酶解溫度和酶解時間對酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽工藝的影響。

1.2.3.1 底物質量濃度對酶解工藝的影響

分別按照底物質量濃度為1、2、3、4、5、6 g/100 mL配制一定體積的溶液，加酶量為16 000 U/g，調pH 8.0，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測定酶解液DPPH自由基清除能力，每個樣品測3 次平行。

1.2.3.2 加酶量對酶解工藝的影響

根據1.2.3.1節確定的最佳底物質量濃度配制一定體積的溶液，加酶量分別為8 000、12 000、16 000、20 000、24 000、28 000 U/g, 調pH 8.0，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測定酶解液DPPH自由基清除能力，每個樣品測3 次平行。

1.2.3.3 pH值對酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質量濃度和加酶量配制一定體積的溶液，分別調溶液pH值至7、8、9、10、11、12，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測定酶解液DPPH自由基清除能力，每個樣品測3 次平行。

1.2.3.4 酶解溫度對酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質量濃度、加酶量和pH值配制一定體積的溶液，分別在40、45、50、55、60、65 ℃水浴下酶解3 h，測定酶解液DPPH自由基清除能力，每個樣品測3 次平行。

1.2.3.5 酶解時間對酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質量濃度、加酶量、pH值配制一定體積的溶液，在1.2.3.4節確定的最佳酶解溫度下，分別酶解0.5、1、2、3、4、5 h，測定酶解液DPPH自由基清除能力，每個樣品測3 次平行。

1.2.4 酶解工藝優化

根據單因素試驗結果，在最佳的酶解時間4 h下，選取酶解溫度、pH值、底物質量濃度、加酶量為自變量，酶解液的DPPH自由基清除率為響應值，采用Box-Behnken原理，進行四因素三水平試驗設計。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

[17]方法，取4 mL新鮮配制的0.15 mmol/L的DPPH乙醇溶液于試管中，加1 mL水解液，振蕩混合均勻，暗處反應20 min，于517 nm波長處測定吸光度，用相同體積的蒸餾水代替樣品做空白對照，每個濃度測3次平行。

式中：A2為4 mL DPPH＋1 mL樣品溶液的吸光度；A1為4 mL乙醇＋1 mL樣品溶液的吸光度；A0為4 mL乙醇＋1 mL水的吸光度。

2 結果與分析

2.1 酶解制備抗氧化肽單因素試驗

2.1.1 底物質量濃度對受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

底物質量濃度對酶解產物的DPPH自由基清除能力的影響如圖1所示，在一定的范圍內，隨著底物質量濃度的增大，酶解物的DPPH自由基清除能力逐漸增強，再增大底物質量濃度，酶解產物清除率不增反降。這可能是由于底物質量濃度的增加，酶與底物之間的接觸面積增大，使酶解效率增高，但當底物質量濃度過高時，導致溶液的黏度增高，影響了酶與底物的作用，使酶解效率降低。

圖1 不同底物質量濃度的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.1.2 加酶量對受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖2 不同加酶量的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

加酶量對酶解產物的DPPH自由基清除能力的影響結果如圖2所示，當加酶量從8 000～12 000 U/g，酶解液的DPPH自由基清除率迅速升高，當加酶量達到20 000、24 000 U/g時，酶解液的DPPH自由基清除率達到最高。這可能是因為在底物充足的情況下，隨著加酶量的增加，酶解反應增強，當酶量達到飽和后，一些活性肽可能會隨著酶解反應的進行再次被酶解，使其清除率下降。從經濟角度考慮，選擇加酶量為20 000 U/g。

2.1.3 酶解pH值對受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

pH值對酶解產物的DPPH自由基清除能力的影響結果如圖3所示，當pH值為9時，酶解產物的抗氧化活性最高，隨著pH值的升高，酶解產物的DPPH自由基清除率呈下降趨勢，這可能是由于在強堿條件下，抑制了酶活力，導致酶解效率下降。所以，選擇pH 9最佳。

圖3 不同酶解pH值的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of pH on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.1.4 酶解溫度對受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖4 不同酶解溫度的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

酶解溫度對酶解產物的DPPH自由基清除能力的影響結果如圖4所示，40～45 ℃隨著溫度升高，DPPH自由基清除率隨著升高，并在45 ℃達到最大值。當酶解溫度高于45 ℃后，酶解產物的DPPH自由基清除率逐漸下降，這可能是由于當酶解溫度小于酶的最適溫度時，隨著溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結構的展開[18]；當溫度繼續升高，超過了酶的最適宜溫度后，酶的活性受到抑制，甚至酶失活，使酶解效率降低。因而，選擇45 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時間對受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖5 不同酶解時間的酶解產物對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of hydro lysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

酶解時間對酶解產物的DPPH自由基清除能力的影響如圖5所示，隨著酶解時間的延長，酶解產物的DPPH自由基的清除能力呈增強的趨勢，酶解4 h，酶解產物的DPPH自由基清除能力最強。這可能是因為在酶解反應的初始階段，酶與底物的濃度較大，酶與底物的充分接觸使酶解反應迅速，隨著反應的進行，底物逐漸被消耗，酶的特異性催化位點減少[19]，使反應減慢，繼續延長酶解時間，使底物被過度酶解，導致酶解產物的DPPH自由基清除能力下降。

2.2 酶解制備抗氧化肽響應面優化工藝

2.2.1 響應面優化工藝結果

表1 制備抗氧化肽響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology for the preparation of antioxidant peptide

采用Design-Export 8.0.6進行響應面優化酶解工藝設計，獲得抗氧化肽制備的四因素三水平試驗結果如表1所示。對試驗數據進行多元回歸擬合，回歸模型系數及顯著性見表2，得到回歸回歸方程為Y＝86.69＋3.07A＋1.13B＋2.59C＋1.89D－0.30AB－0.90AC＋0.30AD＋1.60BC－2.11BD－0.55CD－6.84A2－2.45B2－4.02C2－1.58D2。其中模型一次項A、C、D極顯著，B顯著；模型交互項BD顯著，模型二次項A2、B2、C2極顯著，D2顯著。說明試驗因素對DPPH自由基清除率的影響不是簡單的線性關系。各因素對受精蛋蛋清酶解產物的DPPH自由基清除率大小的影響依次為A＞C＞D＞B。

從表2回歸模型方差分析可知，模型（P＜0.000 1）極顯著，失擬項（P＝0.637 3）不顯著，表明模型與實際擬合程度較好，其中 R2＝0.933 3，說明預測值與實測值之間具有較高的相關性；，說明該模型能解釋86.66%的響應值的變化，所以用該模型能夠較好的優化酶解工藝。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis for the established regression model

2.2.2 響應面分析及因素間交互作用

模型的響應曲面圖和等高線如圖6所示，由等高線的線型可直觀反映出因素間的交互影響，圓形表示兩因素交互影響不顯著，橢圓形表示因素間交互影響顯著[20]。本實驗結果表明，AD、BC、BD的交互作用對酶解產物的DPPH自由基清除率有顯著影響。圖6a表明底物質量濃度4 g/100 mL、pH 9.0條件下，加酶量與溫度之間交互作用顯著，當酶解溫度在40～50 ℃，酶解產物的DPPH自由基的清除率隨著加酶量的增加先增強后減弱，當加酶量較高時，DPPH自由基的清除率變化不明顯。當加酶量在18 000～22 000 U/g，酶解產物的DPPH自由基清除率隨溫度的升高先增強后減弱。當加酶量處于較高水平，溫度處于中間水平時，酶解產物的DPPH自由基清除率較高。當加酶量一定時，溫度增高，DPPH自由基清除率降低，這可能是由于溫度過高，破壞了酶的結構，使活性降低，導致DPPH自由基清除率降低。圖6b表明，當加酶量20 000 U/g，酶解溫度45 ℃時，底物質量濃度與pH值之間交互作用對酶解產物的DPPH自由基清除率有顯著影響。當底物質量濃度一定時，酶解物的DPPH自由基清除率隨著pH值的升高呈先增強后減弱的趨勢，當pH值一定時，酶解產物的DPPH自由基清除率隨著底物質量濃度的升高呈先增強后減弱的趨勢。當底物質量濃度和pH值均處于中間水平時，酶解產物的DPPH自由基清除率達到最高。圖6c表明，在底物質量濃度4 g/100 mL、45 ℃條件下，加酶量和pH值之間交互影響顯著。當pH值處于較低水平時，酶解物的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加而增強，但當pH值處于較高水平時，酶解產物的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加先增強后減弱。當加酶量一定時，酶解產物的DPPH清除率隨pH值的升高先增強后減弱。

圖6 加酶量、溫度、pH值、底物質量濃度交互影響DPPH自由基清除率的響應曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of enzyme amount, hydrolysis temperature, pH and substrate concentration on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.3 模型驗證實驗

由Design-Export 8.0.6對模型分析，得到模型自變量最佳值為酶解溫度46.07 ℃、pH 9.09、底物質量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 015.51 U/g，在此優化條件下酶解產物的DPPH自由基清除率達到87.92%。根據實際條件最終選擇酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g，實際測得的酶解產物的DPPH自由基清除率達到84.97%。理論值87.92%與實際值相對偏差為3.47%，說明模型擬合得到的優化結果較為準確。

3 結 論

采用堿性蛋白酶酶解受精蛋蛋清，以酶解產物的DPPH自由基清除率為指標，采用Design-Export 8.0.6優化得到酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的最佳工藝條件，酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g。酶解4 h后得到的樣品對DPPH自由基的清除率達到84.97%。驗證實驗結果表明，該模型較為可靠，具有較好的預測能力。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Antioxidant Peptides from Fertilized Egg White by Response Surface Methodology

WANG Jun-jie1, ZHAO Yan1,*, TU Yong-gang2, LUO Xu-ying1, LI Jian-ke1, CHEN Zhang-yi1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

This paper reports on the optimization of preparation conditions for antioxidant peptides by hydrolyzing fertilized egg white with alkaline protease. One-factor-at-a-time method was used to explore the effect of hydrolysis temperature, pH, substrate concentration and enz yme amount on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of hydrolysates. Subsequently, the response surface analysis based on Box-Behnken design was employed to optimize the hydrolysis conditions. The results showed that hydrolysates showing the highest DPPH scavenging rate of 84.97% were produced from hydrolysis of fertilized egg white at a substrate concentration of 4.28 g/100 mL at 46 ℃ and pH 9.1 with an enzyme amount of 21 000 U/g. In conclusion, peptides with high antioxidant activity can b e prepared by hydrolyzing fertilized eggs with alkaline protease and the optimized conditions al low accurate theoretical prediction.

fertilized egg; antioxidant peptide; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

TS253.1

A

1002-6630（2014）09-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201409037

2013-06-26

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-TS-201112）；江西省自然科學基金項目（20132BAB214008）

王俊杰（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：hnwjj87@163.com

*通信作者：趙燕（1980—），女，副研究員，博士，研究方向為農產品加工與生物質轉化。E-mail：zhaoyan@ncu.edu.cn