枯草芽孢桿菌產細菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

胡 敏，郝 林，賈麗艷

枯草芽孢桿菌產細菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

胡 敏，郝 林*，賈麗艷

（山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

通過響應面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌HJD.A32產細菌素的發(fā)酵條件，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間30 h、搖床轉速147 r/min、發(fā)酵pH 5.3、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量4%、接種菌齡24 h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下經過氧化氫酶處理的細菌素效價比優(yōu)化前提高了100%，優(yōu)化后發(fā)酵條件下未經過氧化氫酶處理所得細菌素的效價比優(yōu)化之前提高了300%。

細菌素；發(fā)酵條件；響應面法；優(yōu)化

食醋作為歷史悠久的傳統(tǒng)調味品，其安全性早已得到大家的認同[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，食醋在常溫下長期保存不易變質的主要原因除了其低pH值外，還有生產過程中某些微生物產生的能抑制其他細菌生長的抑菌物質，并確定主要的抑菌物質為細菌素[3]。枯草芽孢桿菌HJD.A32所產的細菌素就是其中之一[4-5]。該細菌素對枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌等均有抑制作用，并且有極好的酸堿及熱穩(wěn)定性，在食品安全方面有著良好的應用前景。

細菌代謝產生細菌素能力的大小，除了受菌株自身特性影響外，還受發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等諸多因素的影響[6-12]。本實驗以枯草芽孢桿菌HJD.A32為研究對象，通過響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，從而得到最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

枯草芽孢桿菌HJD.A32、枯草芽孢桿菌H108 由山西農業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

活化培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、指示菌培養(yǎng)基、抑菌實驗培養(yǎng)基均為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

過氧化氫酶 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 抑菌實驗

將發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min取上清液，用過氧化氫酶在37 ℃水浴條件下處理2 h以排除過氧化氫的影響，采用牛津杯法[13]進行抑菌實驗，考察對枯草芽孢桿菌H108的抑菌效果，同時設置未用過氧化氫酶處理組，每個樣品重復3 個平板，最后取平均值。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 發(fā)酵時間對細菌素產量的影響

將活化后的菌齡為24 h的枯草芽孢桿菌HJD.A32以1%接種量接種于pH 7的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)6、12、24、36、48、60 h后，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.2.2 發(fā)酵pH值對細菌素產量的影響

用濃度為0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調至3、4、5、6、7、8、9、10，滅菌后以1%接種量接入活化后的菌齡為24 h的枯草芽孢桿菌HJD.A32，在37 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度對細菌素產量的影響

在pH 5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以1%接種量接入活化后的菌齡為24 h的枯草芽孢桿菌HJD.A32，分別在20、25、30、37、42 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)（150 r/min）24 h后，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.2.4 接種量對細菌素產量的影響

在pH 5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%接入活化后的菌齡為24 h的枯草芽孢桿菌HJD.A32，在30℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.2.5 接種菌齡對細菌素產量的影響

在pH 5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以4%接種量接入活化后的枯草芽孢桿菌HJD.A32，菌齡分別為12、16、20、24 h，30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.2.6 搖床轉速對細菌素產量的影響

在pH 5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以4%接種量接入活化后的菌齡為24 h的枯草芽孢桿菌HJD.A32，30℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，搖床轉速分別設置為0、100、150、200 r/min，測量上清液的抑菌圈直徑。

1.2.3 對產細菌素主要發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗確定發(fā)酵條件各因素的影響順序，選取前3個主要影響因素設計三因素正交旋轉回歸試驗，以細菌素發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑為響應值做響應面設計，得出最優(yōu)發(fā)酵條件[14-19]。

1.2.4 細菌素效價測定

采用二倍稀釋法[6]。取枯草芽孢桿菌HJD.A32發(fā)酵上清液，用滅菌的生理鹽水進行2倍梯度稀釋，取每個稀釋梯度做抑菌實驗，以能夠出現(xiàn)抑菌圈的最高稀釋度定義為一個活力單位（1 AU），其倒數(shù)即為原發(fā)酵液的細菌素效價值（AU/mL）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對細菌素產量的影響

由圖1可知，發(fā)酵時間為6 h時，枯草芽孢桿菌HJD.A32的生長還處于初級階段，此時已有細菌素產生，但產生的量較少。同時發(fā)現(xiàn)6 h時過氧化氫酶處理組和未經過氧化氫酶處理組的抑菌結果相差不多，說明此時也還沒有大量的過氧化氫產生。隨著發(fā)酵時間的延長，細菌素的產量在24 h時達到峰值，此時過氧化氫酶處理組抑菌圈直徑最大，而過氧化氫的產量仍在不斷增長。之后，可能由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質被消耗，有害代謝產物積聚，細菌繁殖速度開始下降，活菌數(shù)量越來越少，同時還伴隨著細菌形態(tài)及生理性狀的改變，使得細菌素的產量呈下降趨勢，過氧化氫的產量則在48 h達到峰值后開始下降。

圖1 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.1 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different fermentation times

2.1.2 發(fā)酵pH值對細菌素產量的影響

圖2 不同發(fā)酵pH值下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.2 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different initial medium pH values

由圖2可知，pH 5～8是枯草芽孢桿菌HJD.A32發(fā)酵產生細菌素的最適pH值范圍，并且在pH 5條件下產細菌素最多。除此之外，過酸和過堿的條件都會抑制細菌的生長，甚至可能由于蛋白質發(fā)生變質而導致細菌死亡。過酸和過堿的條件同時還會抑制過氧化氫的產生，并且在最適pH值范圍內產生的過氧化氫，可能由于極堿的環(huán)境而分解，因此在極酸和極堿條件下的抑菌圈直徑均為0。

2.1.3 發(fā)酵溫度對細菌素產量的影響

由圖3可知，發(fā)酵溫度為20 ℃時枯草芽孢桿菌HJD.A32可能還處于休眠狀態(tài)，因此沒有細菌素及過氧化氫的產生，也就不會出現(xiàn)抑菌圈。隨著溫度的升高，菌株恢復活力，開始生長繁殖同時產生細菌素及過氧化氫。直到發(fā)酵溫度達到30 ℃時，過氧化氫酶處理組抑菌圈直徑達到最大，說明此條件下產細菌 素最多。溫度繼續(xù)升高，細菌的生長繁殖反而受到抑制，高溫時甚至會導致細菌的死亡，因此細菌素的產量開始降低。但由于過氧化氫的熱穩(wěn)定性較高，因此在這一低溫范圍內，過氧化氫對抑菌圈直徑的影響較為平穩(wěn)。

圖3 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.3 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different fermentation temperatures

2.1.4 接種量對細菌素產量的影響

圖4 不同接種量下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.4 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different inoculum amounts

由圖4可知，隨著接種量的提高，細菌素產量也逐漸變大。當接種量達到4%時，細菌素的產量已經很理想，到5%時，細菌素的產量仍在增加，但是增加的幅度已經有所降低。其中，過氧化氫的產量則隨著接種量的增加而有所減少。綜合生產成本等各項因素，選取4%的接種量為最佳接種量。

2.1.5 不同接種菌齡對細菌素產量的影響

圖5 不同接種菌齡下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.5 The diameter of inhibition zone of fermentation liquor from different inoculation cell ages

由圖5可知，隨著接種菌齡的提高，細菌素產量也逐漸變大，最終在接種菌齡為24 h時達到最大。之后，細菌素產量開始下降。在這一過程中，一直有過氧化氫產生，但其產生規(guī)律不是很明顯。

2.1.6 不同搖床轉速對細菌素產量的影響

圖6 不同搖床轉速下發(fā)酵液的抑菌圈直徑Fig.6 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different rotation speeds

由圖6可知，相對靜置發(fā)酵而言，搖床發(fā)酵會增加細菌素的產量。在搖床發(fā)酵過程中，發(fā)酵液隨著搖床的振蕩而增加了溶氧量，這樣既有利于菌株的生長繁殖也促進了細菌素的產生。細菌素的產量也會隨著搖床轉速的提高而增加，轉速提高到150 r/min時，細菌素的產量達到最大。如果繼續(xù)提高轉速，溶氧量反而會因為振蕩過快而減少，細菌素也會因此而適度降低[12]。同時，過氧化氫的產量呈現(xiàn)出與細菌素產量相同的趨勢。

2.2 產細菌素主要發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman試驗及極差分析

表1 二水平試驗及極差分析結果Table 1 Two-level Plackett-Burman experimental design and range analysis

由表1極差分析結果得出，試驗因素對抑菌圈直徑大小即細菌素產量的影響順序依次為：發(fā)酵時間＞搖床轉速＞發(fā)酵pH值＞發(fā)酵溫度＞接種菌齡＞接種量。因此，將發(fā)酵溫度、接種菌齡及接種量分別固定在各自的單因素最佳水平上，即30 ℃、24 h、4%，再通過響應面法來著重考察發(fā)酵時間、搖床轉速及發(fā)酵pH值3 個主要因素對抑菌圈直徑大小即細菌素產量的影響。

2.2.2 中心組合試驗設計及其結果

根據(jù)中心組合試驗設計原理設計響應面分析試驗[15]。試驗選擇15 個試驗點，以發(fā)酵時間、轉速、pH值為自變量，各自選取高（1）、中（0）、低（－1）3 個水平，抑菌圈直徑為響應值，做響應面回歸分析，得出枯草芽孢桿菌HJD.A32產細菌素的最優(yōu)發(fā)酵條件。

表2是中心組合試驗設計方案及結果。試驗點分為兩類：第一類是自變量取值由3 個因素構成的三維頂點，稱為析因點，共12 個；第二類是區(qū)域的中心點，稱為零點，此處試驗重復3 次以估計實驗誤差，如表3所示。

表2 中心組合試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design matrix and results for central composite design

各試驗因素對響應值（Y）的影響可用下列函數(shù)表示：Y=23.473 3＋1.581 25X1－0.683 75X2＋1.79X3－2.931 67X12－1.866 67X22－2.869 17X32－1.21X1X2＋ 2.227 5X1X3－0.637 5X2X3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

如表3所示，P回歸＜0.01，表明回歸方程顯著；P失擬＞0.05，表明失擬項不顯著，即回歸方程擬合顯著；R2＝0.944 3，可知此模型可以解釋94.43%的抑菌圈直徑的原因。

綜上所述，試驗所選模型高度顯著、擬合度高、誤差小，可用來對枯草芽孢桿菌HJD.A32產細菌素的發(fā)酵條件進行預測和分析。

2.2.3 響應面分析及細菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

圖7 當發(fā)酵pH值處于中心水平時發(fā)酵時間和搖床轉速對抑菌圈直徑影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation time and rotation speed on diameter of inhibition zone

由圖7a可知，發(fā)酵時間約在（－1，0.4），即（12，28.8）h范圍內，轉速約在（－1，－0.3），即（100，135）r/min范圍內，二者存在顯著增效作用；而發(fā)酵時間約在（0.4，1.0），即（28.8，36）h范圍內，轉速約在（－0.3，1.0），即（135，200）r/min范圍內，抑菌圈直徑反而隨著二者的增長呈現(xiàn)下降趨勢。由圖7b可知，最大的抑菌圈直徑約為21 mm。

圖8 當發(fā)酵時間處于中心水平時，搖床轉速和發(fā)酵pH值對抑菌圈直徑影響的等值線圖和響應曲面圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of rotation speed and initial medium pH on diameter of inhibition zone

由圖8a可知，搖床轉速約在（－1，－0.25），即（100，137.5）r/min范圍內，發(fā)酵pH值約在（－1，0.3），即（4.5，5.15）范圍內，二者存在顯著增效作用；而搖床轉速約在（－0.25，1.0），即（137.5，200）r/min范圍內，發(fā)酵pH值約在（0.3，1.0），即（5.15，5.5）范圍內，抑菌圈直徑反而隨著二者的增長呈現(xiàn)下降趨勢。由圖8b可知，最大的抑菌圈直徑約為23 mm。

圖9 當搖床轉速處于中心水平時，發(fā)酵時間和發(fā)酵pH值對抑菌圈直徑影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation time and initial medium pH on diameter of inhibition zone

由圖9a可知，發(fā)酵時間約在（－1，0.5），即（12，30）h范圍內，發(fā)酵pH值約在（－1，0.5），即（4.5，5.25）范圍內，二者存在顯著增效作用；而發(fā)酵時間約在（0.5，1.0），即（30，36）h范圍內，發(fā)酵pH值約在（0.5，1.0），即（5.25，5.5）范圍內，抑菌圈直徑反而隨著二者的增長呈現(xiàn)下降趨勢。由圖9b可知，最大的抑菌圈直徑約為20 mm。

為進一步求得枯草芽孢桿菌HJD.A32發(fā)酵條件的最優(yōu)組合，對前面所得回歸方程求一階偏導得：X1＝0.471 43，X2＝－0.055 20，X3＝0.501 06，將這3 個值帶入回歸方程，解得預測的抑菌圈直徑為24.704 9 mm。并求得最佳理論值為：發(fā)酵時間30 h、搖床轉速147 r/min、發(fā)酵pH 5.3。

為驗證預測結果，用上述最優(yōu)發(fā)酵條件做3 個平行實驗，平均抑菌圈直徑為24.43 mm，與預測值之間的擬合度良好，證實此方程有效可靠。

2.3 細菌素效價的測定

通過二倍稀釋法測定得出優(yōu)化發(fā)酵條件下過氧化氫酶處理組細菌素效價為20 AU/mL，較優(yōu)化之前原來經過氧化氫酶處理所得細菌素效價10 AU/mL提高了100%，未經過氧化氫酶處理組為1 280 AU/mL，較優(yōu)化之前發(fā)酵條件下未經過氧化氫酶處理所得細菌素效價320 AU/mL提高了300%。

3 結 論

本實驗得出枯草芽孢桿菌HJD.A32產細菌素的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間30 h、搖床轉速147 r/min、發(fā)酵pH 5.3、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量4%、接種菌齡24 h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下經過氧化氫酶處理的細菌素效價比優(yōu)化前提高了100%，優(yōu)化后發(fā)酵條件下未經過氧化氫酶處理所得細菌素的效價比優(yōu)化之前提高了300%。

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Optimizing Fermentation Conditions for Production of Bacteriocin by Bacillus subtilis HJD.A32

HU Min, HAO Lin*, JIA Li-yan
(College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

This study reports the optimization of fermentation conditions for the production of bacteriocin by Bacillus subtilisHJD.A32. using response surface methodology. The optimal fermentation conditions were determined to be fermentation in a medium at pH 5.3 at 30 ℃ for 30 h with an inoculum density of 4% and an inoculum age of 24 h while shaking at 147 r/min. The potency of bacteriocin produced under the optimal conditions after being treated or not with catalase was raised respectively by 100% and 300% as compared to that produced under the original fermentation conditions.

bacteriocin; fermentation; response surface methodology; optimization

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0198-05

10.7506/spkx1002-6630-201409039

2013-06-24

山西省自然科學基金項目（2011011032-1）

胡敏（1985—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發(fā)酵。E-mail：humin123@163.com

*通信作者：郝林（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：haolinsxnd@126.com