響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶工藝

李 娟，曹澤虹，李 超，高明俠，高兆建，王 春，陳 闊，靳衛(wèi)濤，張晨杰，林占勝，李雪晴，王 娟

響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶工藝

李 娟，曹澤虹*，李 超，高明俠，高兆建，王 春，陳 闊，靳衛(wèi)濤，張晨杰，林占勝，李雪晴，王 娟

（江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇省食品與生物工程實驗中心，徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008）

以黑曲霉菌種作為菌源，利用深層發(fā)酵法生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶。通過測定發(fā)酵液酶活力，從20株黑曲霉菌株篩選得到產(chǎn)菊粉酶活力最高的1 株黑曲霉菌株，酶活力為3.05 U/mL。通過單因素試驗對最佳工藝條件進行研究，結(jié)果表明：培養(yǎng)基裝液量為100 mL/250 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量1 cm2/250 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min、pH 5.0。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗原理設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，得到最佳工藝條件為：發(fā)酵液裝液量 99 mL/250 mL、接種量0.99 cm2/250 m L、培養(yǎng)溫度31 ℃、轉(zhuǎn)速 180 r/min、pH 5.0。在此條件下，測得內(nèi)切型菊粉酶的酶活力為 6.43 U/mL，比初始酶活力提高了 111%。

菊粉酶；黑曲霉；深層發(fā)酵；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

低聚果糖（fructooligosaccharides）是在蔗糖分子的果糖殘基上以β-1,2-鍵結(jié)合1～3 個果糖的低聚糖。它是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，低聚果糖甜度高、易溶解、能避免由蔗糖、葡萄糖引起的齲齒。其發(fā)熱量少，是功能食品原料之一[1-2]。工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖有兩種方法，一種是由蔗糖經(jīng)β-果糖轉(zhuǎn)移酶（β-fructosyl transferase）或轉(zhuǎn)化酶（invertase）的轉(zhuǎn)果糖基反應(yīng)而生成的蔗果糖類，其產(chǎn)品中副產(chǎn)物葡萄糖和蔗糖多，反應(yīng)不易控制。另一種是由內(nèi)切型菊粉酶水解菊粉而成，產(chǎn)物為低聚果糖和少量果糖，與傳統(tǒng)的以蔗糖作為原料生產(chǎn)低聚果糖的工藝相比，具有工藝簡單、生產(chǎn)成本低、低聚果糖含量高（70%～90%）等優(yōu)點。微生物產(chǎn)生的菊粉酶是低聚果糖工業(yè)化生產(chǎn)的主要酶制劑。霉菌所產(chǎn)菊粉酶的最適溫度高、熱穩(wěn)定性好、適宜偏酸性的環(huán)境，對于菊粉酶用于低聚果糖工業(yè)化生產(chǎn)及防止生產(chǎn)中的污染十分有利[3]。

目前，我國對于該項研究重點是高產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選和發(fā)酵條件的確定。目前外切型菊粉酶的報道較多，而對于內(nèi)切型菊粉酶的研究報道較少。華僑大學(xué)的羅顛輝[4]從腐爛的牛蒡根際土壤中篩選出1菌株，為黑曲霉AC1，利用牛蒡菊糖為原料生產(chǎn)低聚果糖，酶活力可達26.41 U/mL。湖北工業(yè)大學(xué)的陳雄[5]利用固體發(fā)酵篩選得到1 株克魯維酵母S120高產(chǎn)菊粉酶菌株，酶活力達118.28 U/g干質(zhì)量。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)的祝彥忠等[6]用黑曲霉Ur-2利用紫外線和60Co ?射線誘變選育出菊粉酶高產(chǎn)菌株，其酶活力達180.33 ?mol/（min·mL）。在我國，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所、湖北大學(xué)、大連輕工業(yè)學(xué)院、西北農(nóng)業(yè)大學(xué)等已經(jīng)開展研究，利用菊芋、雪蓮果等植物中的菊粉作為原料，通過黑曲霉、酵母等微生物產(chǎn)生的菊粉酶進行酶法生產(chǎn)低聚果糖，并申請了相關(guān)的國家發(fā)明專利。但利用菊糖生產(chǎn)低聚果糖的生產(chǎn)卻仍未實現(xiàn)[7]。

本實驗以徐州工程學(xué)院食品與生物工程實驗中心酶工程實驗室保藏的黑曲霉菌種作為菌源，利用深層發(fā)酵法生產(chǎn)內(nèi)切型菊粉酶；利用單因素試驗和響應(yīng)面法對內(nèi)切型菊粉酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，以期獲得內(nèi)切型菊粉酶生產(chǎn)的最佳工藝條件, 為利用牛蒡生產(chǎn)低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

牛蒡 徐州市百惠佳美時超市；菊糖 美國Sigma公司。

20 株黑曲霉菌株為徐州工程學(xué)院食品與生物工程實驗中心酶工程實驗室保藏。

初篩培養(yǎng)基：牛蒡汁3 mL（0.2g/mL）、蛋白胨1 g、酵母膏1 g、瓊脂2 g、水100 mL，pH值自然。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：牛蒡汁10 mL（0.2 g/mL）、酵母膏1 g、磷酸氫二鉀1.5 g、瓊脂 2g、水100 mL，pH值自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛蒡汁2 mL（0.2 g/mL）、牛肉膏1.6 g、磷酸氫二鉀0.5 g、磷酸氫二銨1.6 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂2 g、水100 mL，pH值自然[4-7]。以上培養(yǎng)基配制好后，在121 ℃溫度條件下高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7230G型可見分光光度計、FA2104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、GZX-DH-600電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HYG型回旋式恒溫調(diào)速搖瓶機 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；250D恒溫光照培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；SW-CJ-IF潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BCD-13OH TB海爾冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡汁的制備

取鮮牛蒡去皮、洗凈，稱取濕質(zhì)量300 g加入沙冰機中，加適量水?dāng)囁椋盟膶蛹啿歼^濾，濾渣適量加水重復(fù)壓濾，濾液濃度為300 g牛蒡出300 mL汁（即為0.2 g/mL牛蒡汁），pH值自然，0.1 MPa滅菌30 min備用。

1.3.2 內(nèi)切型菊粉酶酶活力的測定[3-8]

內(nèi)切型菊粉酶酶活力的測定方法：發(fā)酵液經(jīng)過6 000 r/min離心10 min，取一定濃度的酶液1.0 mL，加4.0 mL的牛蒡菊糖溶液，50 ℃條件下反應(yīng)10 min，用3,5-二硝基水楊酸法測定產(chǎn)生還原糖的量，即向各管中加入3,5-二硝基水楊酸1.5 mL混勻，置于沸水浴中加熱5 min，取出立即用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，在540 nm波長處測定各管的OD540nm值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)和OD540nm值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準曲線，獲得回歸方程y＝0.018x－0.004 9（R2=0.999 1），計算酶活力。內(nèi)切型菊粉酶活力單位定義為：在pH 5、50 ℃條件下每分鐘水解菊糖生成1 μmol還原糖所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.3.3 黑曲霉菌株的活化與篩選[6-14]

活化3 代，將保藏的20 株菌株分別接種于初篩培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；待黑曲霉孢子長出后，再接種于初篩培養(yǎng)基斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2 d；待黑曲霉孢子長出后，再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿上30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。待黑曲霉孢子長出后，取1 cm2的孢子及培養(yǎng)基接種于裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于搖瓶中，在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液過濾后，取1 mL測定發(fā)酵液的酶活力，篩選出酶活力最高的菌株。

1.3.4 內(nèi)切型菊粉酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝單因素試驗[3-6,10]

1.3.4.1 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量的選擇

在250 mL的錐形瓶中分別加入60、80、100、120、140 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，將酶活最高的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1.0 cm2的孢子及培養(yǎng)基/250 mL，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d后，測定發(fā)酵液的酶活力，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量。

1.3.4.2 最佳接種量的選擇

在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，再分別加入0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 cm2的孢子及培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d后測定發(fā)酵液的酶活，確定最佳菌種接種量。

1.3.4.3 最佳發(fā)酵溫度的選擇

在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，再接入1.0 cm2的孢子及培養(yǎng)基，分別在24、27、30、33、36 ℃溫度下，在180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d后，測定發(fā)酵液的酶活，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.4.4 最佳轉(zhuǎn)速的選擇

在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，再接入1.0 cm2的孢子及培養(yǎng)基，分別用120、150、180、210、240 r/min的轉(zhuǎn)速，在30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d后，測定發(fā)酵液的酶活，以確定最佳轉(zhuǎn)速。

1.3.4.5 最佳pH值的選擇

在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，再接入1.0 cm2的孢子及培養(yǎng)基，分別在pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0條件下，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d后，測定酶活力，確定最佳pH值。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件[15-22]

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗（central composite design，CCD）原理設(shè)計方案，對裝液量（X1）、接種量（X2）和溫度（X3）進行曲面響應(yīng)試驗設(shè)計，并以＋1、0、－1分別代表變量的水平，按方程xi＝（Xi－X0）/ΔX對自變量進行編碼，其中，xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實值，X0為試驗中心點變量的真實值，ΔX為變量的變化步長，酶活力為響應(yīng)值（Y）。采用SAS對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。

1.3.6 黑曲霉的菌種鑒定[23-25]

將菌樣寄給生工生物工程（上海）股份有限公司進行菌種鑒定，對菌種的18S rDNA進行全序列分析，然后利用基因庫進行比對，最后建立系統(tǒng)進化樹，確定菌種所屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉菌株的活化與篩選

以牛蒡汁為碳源，20 株黑曲霉菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的酶活力結(jié)果如表1所示。菌株08013的酶活力最高，為3.05 U/mL，后期實驗以08013菌株作為實驗菌株。

表1 20 株黑曲霉菌株的酶活力Table 1 Endoinulinase activities of twenty Aspergillus niger strains

2.2 內(nèi)切型菊粉酶發(fā)酵工藝條件單因素試驗

2.2.1 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量的確定

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量對內(nèi)切型菊粉酶活力的影響Fig.1 Effect of culture medium volume on the endoinulinase activity

如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的裝瓶量從60 mL/250 mL到 100 mL/250 mL時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈上升趨勢，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的裝瓶量為100 mL/250 mL時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力最高，為6.27 U/mL；當(dāng)裝瓶量繼續(xù)增加時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈下降趨勢，說明在100 mL/250 mL時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的量與微生物的接種量達到最合適的比例，因此內(nèi)切型菊粉酶的酶活達到最高。

2.2.2 最佳菌種接種量的確定

圖2 菌種接種量對內(nèi)切型菊粉酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculum concentration on the endoinulinasec activity

如圖2所示，當(dāng)菌種接種量從0.2 cm2/250 mL到1 cm2/250 mL時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈上升趨勢，當(dāng)菌種接種量為1 cm2/250 mL時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力最高，為6.41 U/mL；當(dāng)菌種接種量從1.0 cm2/250 mL到1.8 cm2/250 mL時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈下降趨勢，說明在菌種接種量為1 cm2/250 mL時，菌種數(shù)量和培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)的量達到最適合的比例，因此內(nèi)切型菊粉酶的酶活力達到最高。

2.2.3 最佳發(fā)酵溫度的確定

圖3 發(fā)酵溫度對內(nèi)切型菊粉酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the endoinulinase activity

如圖3所示，當(dāng)發(fā)酵溫度從24 ℃升至30 ℃時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈上升趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力最高，為6.42 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度從30 ℃升至36 ℃時，內(nèi)切型菊粉酶的酶活力呈下降趨勢，說明在30 ℃時，菌株的生長達到最佳狀態(tài)，酶活力達到最高。

2.2.4 最佳轉(zhuǎn)速的確定

圖4 搖瓶機轉(zhuǎn)速對酶活力的影響Fig.4 Effect of shaking speed on the endoinulinase activity

如圖4所示，當(dāng)搖瓶機轉(zhuǎn)速從120 r/min升至180 r/min時，內(nèi)切型菊粉酶的活力呈上升趨勢，當(dāng)搖瓶機轉(zhuǎn)速為180 r/min時，內(nèi)切型菊粉酶的活力最高，為6.42 U/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高時，內(nèi)切型菊粉酶的活力呈下降趨勢，說明當(dāng)搖瓶機轉(zhuǎn)速為180 r/min時，培養(yǎng)基中的含氧量最適合菌種的發(fā)酵生產(chǎn)，酶活力也最高。

2.2.5 最佳pH值的確定

如圖5所示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值從4.0升至5.0時，內(nèi)切型菊粉酶的活力呈上升趨勢；當(dāng)pH值為5.0時，內(nèi)切型菊粉酶的活力最高，為6.28 U/mL；當(dāng)pH值從5.0升至6.0時，內(nèi)切型菊粉酶的活力呈下降趨勢，說明該酶適合在偏酸性條件下發(fā)揮作用。

圖5 pH值對內(nèi)切型菊粉酶活力的影響Fig.5 Effect of medium pH on the endoinulinase activity

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

2.3.1 模型的建立及其顯著性檢驗

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量、菌種接種量和發(fā)酵溫度這3 個影響比較大的因素為主要因素，采用CCD響應(yīng)面試驗設(shè)計方案，試驗結(jié)果和方差分析如表2、3所示。

表2 CCD優(yōu)化試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Central composite design scheme and results for the optimization of fermentation conditions

由表3可知，模型具有極顯著性（P＜0.01），失擬項（P＞0.05）不顯著以及R2Adj＝0.985和信噪比（RSN）為33.292，遠大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗誤差較小，說明模型相關(guān)度很好，自變量與響應(yīng)值之間存在線性關(guān)系，模型是非常顯著的，因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以用于最佳發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，所以可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出相應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖6所示。響應(yīng)值存在最大值，各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，相互作用顯著，而且能清晰地看到最高點。說明裝瓶量與接種量之間、裝瓶量與溫度之間、溫度與接種量之間的相互作用顯著，所以可以對裝瓶量、接種量、溫度3 個作用比較顯著的因素進行分析計算，從而得出最佳發(fā)酵工藝條件。

經(jīng)SAS軟件分析計算，得到最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量99 mL/250 mL、菌種接種量0.99 cm2/250 mL、溫度31 ℃，此時酶活力可達6.43 U/mL，比初始菌株的酶活力提高了111%。

2.3.3 驗證實驗

為檢驗CCD試驗設(shè)計所得結(jié)果的可靠性，在上述最優(yōu)條件下進行3 次平行實驗，實際測得的平均酶活力為6.42 U/mL，與預(yù)測值基本相符，因此基于CCD驗設(shè)計所得的最佳發(fā)酵工藝條件準確可靠，具有實用價值。

2.4 黑曲霉菌株的鑒定

通過對實驗菌株08013的18S rDNA進行全序列分析，得到1 308 bp長的序列。將該序列用GenBank進行比對，根據(jù)同源性分析表，建立系統(tǒng)進化樹如圖7所示。08013菌株與GU226429菌株黑曲霉（Aspergillus niger）的同源性達到99%，所以鑒定菌株08013為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖7 黑曲霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Aspergillus niger strains

3 結(jié) 論

對實驗室原有保藏的20 株黑曲霉菌株活化和發(fā)酵，通過測定發(fā)酵液酶活，篩選出1 株編號為08013的內(nèi)切型菊粉酶菌株，其酶活力為3.05 U/mL。通過對08013菌株的發(fā)酵生產(chǎn)工藝的單因素試驗，得出各單因素的最佳條件：最佳發(fā)酵培養(yǎng)基裝瓶量為100 mL/250 mL，最佳溫度為30 ℃，最佳菌種接種量為1 cm2/250 mL；最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min；最佳pH值為5.0。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用CCD響應(yīng)面法軟件優(yōu)化工藝條件，得到最佳工藝條件為：發(fā)酵液裝瓶量99 mL/250 mL、菌種接種量 0.99 cm2/250 mL、溫度31 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、pH 5.0，在此條件下，測得內(nèi)切型菊粉酶的酶活為 6.43 U/mL。通過對發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，使最終酶活力比初始酶活（3.05 U/mL）提高了111%。

通過對實驗菌株08013的18S rDNA進行全序列分析，再進行基因庫比對，建立系統(tǒng)進化樹，得知08013菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）。

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Optimization of Submerged Fermentation Conditions by Response Surface Analysis for Endoinulinase Production by Aspergillus niger

LI Juan, CAO Ze-hong*, LI Chao, GAO Ming-xia, GAO Zhao-jian, WANG Chun, CHEN Kuo, JIN Wei-tao, ZHANG Chen-jie, LIN Zhan-sheng, LI Xue-qing, WANG Juan

(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development, Quality and Safety, Jiangsu Experiment Center of Food and Biological Engineering, College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Aspergillus niger 08013, showing the highest endoinulinase activity of 3.05 U/mL was screened from 20 Aspergillus niger strains conserved in our laboratory. The results of one factor-at-a-time experiments showed that the appropriate fermentation conditions were 100 mL of medium in a 250-mL triangular flask, 30 ℃, an inoculum size of 1 cm2/250 mL, shaking at a speed of 180 r/min and pH 5.0. The optimal fermentation conditions were determined by central composite design and response surface methodology to be 99 mL of medium in a 250-mL triangular flask, 31 ℃, an inoculum size of 0.99 cm2/250 mL, shaking at a speed of 180 r/min and pH 5.0. Under the optimized conditions, the activity of endoinulinase produced by the strain 08013 was 6.43 U/mL, which was increased by 111% as compared to the initial activity before the optimization, 3.05 U/mL.

inulinase; Aspergillus niger; submerged fermentation; response surface analysis; optimization

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0207-06

10.7506/spkx1002-6630-201409041

2013-09-29

江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃項目（07KJD550202）；徐州市科技發(fā)展指導(dǎo)性計劃項目（XZZD1204）；徐州工程學(xué)院校級培育課題（XKY2011109）；2013年度國家星火計劃項目（2013GA690418）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項目（13KJD550006）；徐州市科技計劃項目（XF12C028）；江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（XCX2014039）

李娟（1991—），女，本科，研究方向為食品加工技術(shù)。E-mail：82484948@qq.com

*通信作者：曹澤虹（1963—），女，副教授，本科，研究方向為食品生物技術(shù)與酶工程。E-mail：czh001001@163.com