杏鮑菇污染菌的分離、鑒定及其特性

姚璐曄，沈金波，戴 璐，裴丹丹，孫丹鳳，冀 宏

杏鮑菇污染菌的分離、鑒定及其特性

姚璐曄，沈金波，戴 璐，裴丹丹，孫丹鳳，冀 宏

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

從夏季被細菌污染的杏鮑菇上分離純化得到2株病害菌（CTE722-B、CTE722-C），結合顯微結構和生理生化實驗結果，以及對它們16S rDNA序列的分析確定這兩株菌的系統發育地位；通過抑菌圈實驗考察幾種工廠常用消毒劑對病害菌的抑菌影響。結果表明：菌株CTE722-B鑒定為惡臭假單胞菌屬（Pseudomonas putida），CTE722-C為邊緣假單胞菌屬（Pseudomonas marginalis）。消毒劑菇保、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液在短時間內對這兩種細菌都有較好的抑菌效果；但因其具有揮發性，故防治效果不理想。從污染菇體分離得到的2株病害菌CTE722-B和CTE722-C被鑒定為假單胞菌屬，因常用消毒劑只在短時間內對其有抑菌性，防治效果較差。

杏鮑菇；病害菌；假單胞菌；特性

隨著食用菌周年生產、多品種栽培的實現及栽培規模的不斷擴大，食用菌病原病害的發生亦日趨嚴重。我國每年由病害菌造成的損失一般在10%以上，嚴重的地方可達90%[1]。食用菌的病原病害是指食用菌由于受到其他有害微生物寄生而引起的病害，也稱為侵染性病害。引起食用菌病害的微生物稱為病原菌，主要以細菌為主，包括拖拉氏假單胞菌（Pseudomonas tolasii）[2]、pv.agaricicola[3]、產堿假單胞菌（P. alcaligenes）[4]、熒光假單胞菌（P. fluorescens）[5]、洋蔥假單胞菌（P. cepaica）[6]和蘑菇假單胞菌（P. agarici）[7]。我國研究者對部分食用菌的細菌性病害也有深入研究，如關于半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）的報道，該菌侵染蘑菇子實體后，一般表現為生長發育受阻，嚴重的長大會變成僵菇或萎縮菇[8]。但這些研究都因缺乏后續的研究，尚未提出可靠有行的防治方法；而在實際生產中依然只能根據以往的經驗總結出防治措施，造成理論研究與實際生產之間的脫節。

本研究以昆山一家杏鮑菇生產廠多發于夏季的細菌污染菇為樣本，對其進行分離純化培養，并依據菌落特征、生理生化實驗及分子生物學手段對分離得到的病原菌進行種屬的鑒定，并研究了常用消毒劑對其的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

杏鮑菇 昆山振興食用菌有限公司提供。

牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏3、NaCl 5、蛋白胨10，pH 7.2～7.4。

菇保（二氯異尿酸鈉產品）、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液及高錳酸鉀 昆山振興食用菌有限公司。

1.2 儀器與設備

M124A電子天平 伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；FE20便攜式（數顯）pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CJ-2S超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；ZQWY-200G振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；PQX-280A-22HM人工氣候箱 寧波萊?？萍加邢薰荆籆entrifuge 5418R高速冷凍離心機、移液槍 德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 病害菌的分離純化

取10 g病態杏鮑菇的部分組織加入90 mL無菌生理鹽水，振蕩20 min，稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養基上，30 ℃培養24 h，挑取一環單菌落，保存在牛肉膏蛋白胨斜面培養基上備用。

1.3.2 病害菌的生理生化鑒定

對經分離純化得到的菌株進行顯微結構、染色觀察及相關生理生化鑒定[9-13]。

1.3.3 病害菌的分子生物學鑒定

提取菌株的16S rDNA，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（No. D310），進行PCR擴增目的片段。反應條件具體為：94 ℃、5 min ；94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30 次循環；72 ℃、5 min 。反應結束，取5 μL反應液進行3%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。送于上海寶生物公司進行測序，測序結果在GenBank中進行BLAST比對。選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對象，用CLUSTAL X軟件進行多序列比對并計算目標菌株與參比菌株之間的序列相似性[14-15]，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）[16-17]，應用MEGA 4.0軟件構建目標菌株與參比菌株之間的系統進化樹[17]。

1.3.4 消毒劑抑菌效果實驗

取0.2 mL菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，用無菌鑷子將含消毒劑（菇保 0.2 g/mL、甲酚皂 10%、苯扎溴銨消毒液 0.071 mL/mL）的濾紙片（濾紙片直徑10 mm）置于平板上，30 ℃培養24 h，用卡尺測量抑菌圈大小。以所測抑菌圈的平均直徑（mm）來表示藥劑對細菌的抑菌力。抑菌效果用下式[18]表示。

在實際生產中，每天都會使用消毒劑對操作空間、工人等進行消毒，但仍出現了細菌污染現象。對此實驗將消毒劑敞開放置不同時間之后，考察其抑菌效力。具體過程如下：分別將消毒劑敞口放置0.5、1、1.5、2 h后，用無菌鑷子將含放置不同時間的消毒劑的濾紙片置于事先涂布的平板上，30 ℃培養24 h，用卡尺測量抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 污染杏鮑菇樣本的性狀

圖1 菌絲包（A）和菇體污染樣本（B）Fig.1 Polluted mycelia (A) and fruit bodies (B) of Pleurotus eryngii

如圖1所示，污染杏鮑菇樣本在菌絲生長階段，在料袋上出現零星的黃色水珠，黏度不大，這一現象導致菌絲長滿袋的時間延長5～7 d；且這現象一般出現在袋口附近，緩慢向下蔓延至整個料包的1/4為止。出現這種現象的料包在菌絲長滿之后進入出菇環節，經過正常的消毒環節后，長出子實體，但隨著子實體的增大，菇體會出現大量黃色黏稠狀水珠，隨著培養時間的延長，被污染的菇體最終會腐爛，而與之接觸的健康菇體也會被感染，出現相同的癥狀。

在菌絲生長階段，若在無菌條件下去除黃色水珠，會大幅度降低后期菇體的污染情況以及推遲出現黃色黏稠液體的時間。因此斷定，菌絲生長階段出現的黃色水珠與后期在子實體上的黃色液體為同一菌株的胞外分泌物。

2.2 污染病害菌的分離

圖2 平板培養的兩種菌株Fig.2 The two strains cultured on plates

分別挑取菌絲料包上的水珠和污染菇體，進行涂布培養。如圖2所示，兩個樣本的培養結果類似，均出現了兩種細菌，證實這一污染現象是由兩種微生物引起，分別命名為CTE722-B和CTE722-C；只是兩者比例有差異，前者CTE722-B較多，CTE722-C較少，后者則反之。在培養基培養24 h，CTE722-B為半透明、淡黃色的圓形菌落，表面隆起，邊緣略粗糙；CTE722-C為半透明、乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑；CTE722-B的菌落直徑較CTE722-C的大。

2.3 病害菌的個體形態特征

圖3 CTE722-B（A）和CTE722-C（B）的革蘭氏染色結果（×1 000）Fig.3 Gram staining of CTE722-B (A) and CTE722-C (B)(×11 000000)

通過普通光學顯微鏡對病害菌的菌體形態進行觀察，結果如圖3所示，CTE722-B為桿菌，不呈螺旋形，不產芽孢，細胞以單個排列，革蘭氏染色陰性；CTE722-C為短桿菌，不產芽孢，細胞單個排列，革蘭氏染色陰性。

2.4 病害菌的生理生化實驗

2.4.1 菌株CTE722-B的生理生化特征

表1 菌株CTE722-B與假單胞菌屬部分菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain CTE722-B and some species of the genus Pseudomonas

由表1可知，病害菌CTE722-B能夠氧化利用葡萄糖產酸，不能發酵乙醇產酸，接觸酶和氧化酶反應均為陽性，兼性厭氧。結合細胞形態、革蘭氏染色等結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》[11-12]，初步判斷病害菌CTE722-C屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）的細菌。參照上述細菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進行了其他生理生化實驗，并和Pseudomonas的細菌進行比較。病害菌CTE722-B生理生化實驗結果和惡臭假單胞菌（P. putida）基本一致，結合細胞形態、革蘭氏染色等結果，初步判斷病害菌CTE722-B 是一株惡臭假單胞菌（P. putida）。

2.4.2 菌株CTE722-C的生理生化特征

表2 菌株CTE722-C與假單胞菌屬部分菌株的生理生化特征Table 2 Physiological properties of strain CTE722-C and some species of the genus Pseudomonas

由表2可知，病害菌CTE722-C能夠氧化利用葡萄糖產酸，不能發酵乙醇產酸，接觸酶和氧化酶反應均為陽性，兼性厭氧。結合細胞形態、革蘭氏染色等結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》[11-12]，初步判斷病害菌CTE722-C屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）的細菌。參照上述細菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進行了其他生理生化實驗，并和Pseudomonas的細菌進行比較。

從表2中可以看出，病害菌CTE722-C生理生化實驗結果和邊緣假單胞菌（P. marginalis）基本一致，結合細胞形態、革蘭氏染色等結果，初步判斷病害菌CTE722-C是1株邊緣假單胞菌（P. marginalis）。

2.5 16S rDNA序列分析

圖4 菌株CTE722-B和CTE722-C的16S rDNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis patterns of 16S rDNA products from strains CTE722-B and CTE722-C

如圖4所示， 通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，得到PCR產物，切膠回收片段進行DNA測序。將菌株CTE722-B的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的細菌16S rDNA序列進行BLAST同源性比對，結果發現CTE722-B的16S rDNA序列與數據庫中Pseudomonas屬細菌的16S rDNA序列自然聚類。在16 個最相近的系列中（同源性99%～100%），假單胞菌（Pseudomonas）占12 個，其余4 個為未鑒定細菌。同理，將菌株CTE722-C的16S rDNA序列與相關序列進行同源性比對，同樣有16 個最相近的序列（同源性99%～100%），假單胞菌（Pseudomonas）占15 個，其余1 個為未鑒定細菌。選取合適的序列與菌株CTE722-B、CTE722-C用MEGA4.0軟件構建系統發育樹，結果如圖5所示。CTE722-B與P. putida（登記號：AB680572）聚為一群，CTE722-C與P. marginais（登記號：JQ438826）聚為一群，再次表明CTE722-B屬于P. putida，CTE722-C屬于P. marginais。

圖5 基于16S rDNA的菌株CTE722-B和CTE722-C的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains CTE722-B and CTE722-C based on their 16S rDNA sequences

2.6 不同消毒劑對病害菌的抑菌效果

如表3所示，幾種常用的消毒劑中，高錳酸鉀對菌株CTE722-B、CTE722-C無抑菌作用，其余3種消毒劑對病害菌有抑菌效果，菇保效果最佳?？疾旆胖靡欢螘r間后消毒劑的抑菌效力，結果如圖6～8所示。隨著放置時間的延長3 種消毒劑對病原菌的抑菌效果逐步降低；在放置的2 h內，3 種消毒劑的抑菌效果都出現了顯著下降；其中甲酚皂和苯扎溴銨消毒液在放置2 h后，抑菌效果僅為10%左右，幾乎沒有抑菌作用。0.2 g/mL的菇寶溶液對病原菌有顯著的抑菌效果，雖然放置時間延長會導致抑菌效果下降，但在2 h仍能保持30%的抑菌效果，這一特性對于工廠消毒是有利的。

表3 3 種消毒劑平板抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effects of three sanitizers

圖6 菇保不同放置時間對抑菌效力的影響Fig.6 Effect of air-exposure time of dichloroisocyanuric acid sodium salt before use on bacteriostasis

圖7 甲酚皂不同放置時間對抑菌效力的影響Fig.7 Effect of air-exposure time of cresol soap before use on bacteriostasis

圖8 苯扎溴銨消毒液不同放置時間對抑菌效力的影響Fig.8 Effect of air-exposure time of benzalkonium bromide before use on bacteriostasis

3 結 論

本實驗的研究對象為引起杏鮑菇生產廠（昆山正興食用菌有限公司）夏季常見污染現象的病害菌。通過分離純化得到兩株病害菌（CTE722-B、CTE722-C）；根據菌體形態特征、培養特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結果以及系統發育學特征，根據多相分類原則，可將病害菌CTE722-B鑒定為惡臭假單胞菌種（P. putida）的菌株，CTE722-C為邊緣假單胞菌種（P. marginalis）。

考察該工廠常用的消毒劑，菇保（二氯異尿酸鈉產品）、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液及高錳酸鉀對菌株CTE722-B、CTE722-C的抑菌效果。結果表明質量濃度為0.2 g/mL的菇保溶液抑菌效果最佳。菇寶的主要成分是二氯異氰尿酸納，常采用燃燒產生煙霧的方式對空氣環境及物體表面進行消毒。在工廠的制種車間使用時，一般是在消毒后的0.5 h后完成無菌操作，這一操作要求與實驗結果一致；但在對于一般廠房的消毒，常采用甲酚皂和苯扎溴銨消毒液輪流使用。因此即使在嚴格的操作流程下，生產期間仍出現了不同規模的染菌現象?；诒敬螌嶒灲Y果，建議工廠可使用菇寶對菌絲發生室及菇房進行消毒，從而降低由惡臭假單胞菌種（P. putida）和邊緣假單胞菌種（P. marginais）造成的污染情況。但由于菇寶揮發的氣味刺激性較強，長期在開放的環境下使用會造成污染，因此尋求更合適的防治方法是必需的，而本研究內容也將為后續防治方法的探尋提供理論依據。

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Isolation, Identification and Characterization of Contaminant Bacteria from Pleurotus eryngii

YAO Lu-ye, SHEN Jin-bo, DAI Lu, PEI Dan-dan, SUN Dan-feng, JI Hong

(School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

This study aimed to identify and characterize the pathogenic bacteria which caused pollution in Pleurotus eryngii. Two strains named CTE722-B and CTE722-C were isolated from Pleurotus eryngii polluted in summer collected from a mushroom factory. According to their microstructure, physiological, biochemical properties and 16S rDNA sequences, the phylogenetic positions of the two strains were defined. By measuring the diameter of inhibition zone, the efficacy of sanitizers commonly used in the food industry against them was investigated. The results showed that CTE722-B and CTE722-C were identified as Pseudomonas putida and Pseudomonas marginais, respectively. Although the growth of two strains was restrained within a short time after adding dichloroisocyanuric acid sodium salt, cresol soap or benzalkonium bromide into the medium, the antibacterial efficacy of these sanitizers was poor due to the high volatility.

Pleurotus eryngii; pathogenic bacteria; Pseudomonas; characteristics

Q936

A

1002-6630（2014）09-0213-05

10.7506/spkx1002-6630-201409042

2013-06-24

蘇州應用基礎研究項目 （SYN201007；SYN201212）；江蘇省高等學校大學生實踐創新計劃項目（201210333014）；常熟理工學院重點畢業論文資助項目（LG27）

姚璐曄（1983—），女，實驗師，碩士研究生，研究方向為食用菌育種及其病害菌。E-mail：yaoluye@cslg.com