酪蛋白糖巨肽對小鼠腹腔吞噬細胞及腸黏膜免疫細胞的影響

葉 雷，陳慶森，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

酪蛋白糖巨肽對小鼠腹腔吞噬細胞及腸黏膜免疫細胞的影響

葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

目的：由于酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）具有許多生理活性功能和獨特營養特性，研究CGMP對小鼠腹腔免疫細胞以及腸黏膜屏障的影響可為其應用于保健食品和醫藥品提供科學依據。方法：以96只健康昆明雌性小鼠為實驗動物，利用流式細胞儀、HE染色和免疫熒光標記技術，分別檢測分析了灌胃不同劑量的CGM P（30 μg/d和120 μg/d）對實驗小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性以及腸上皮內淋巴細胞（intraepithellal lymphocytes，IEL）和固 有層IgA+漿細胞數量的影響，探討CGMP改善小鼠腹腔吞噬細胞和腸黏膜屏障功能的作用。結果：CGMP能夠顯著增加小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬能力，灌胃時間越長，作用效果越明顯；其中灌胃CGMP的劑量為120 μg/d的作用效果優于30 μg/d劑量組。且與對照組相比，灌胃CGMP組小鼠十二指腸上皮內淋巴細胞數和固有層IgA+漿細胞數量顯著增加（P ＜ 0.01）。結論：CGMP可以增強小鼠腹腔吞噬細胞吞噬功能，誘導腸道黏膜免疫應答，增強腸黏膜免疫屏障功能，有望開發為抑制腸道炎癥的功能性食品添加劑。

酪蛋白糖巨肽；腸黏膜屏障；吞噬細胞；腸上皮內淋巴細胞；IgA+漿細胞

近年來，隨著對炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、多臟器功能衰竭、細菌移位、腸源性感染等研究的深入，人們對腸道復雜生理功能有了新的認識，注意到腸道不僅是消化和吸收營養物質的重要臟器，而且還具有其他功能，如免疫調節、內分泌功能、黏膜屏障功能。不論腸道的原發 性病變，還是繼發性損害，均會造成腸功能不同程度的損傷。當前臨床研究的熱點主要是腸黏膜屏障功能（gut barrier function），腸道黏膜屏障是存在于腸道內的具有高效選擇性功能的屏障系統[1]，由腸黏膜非特異免疫屏障和腸黏膜特異性免疫屏障組成[2]，它在保護機體免受食物抗原、防御微生物及其產生的有害代謝產物的損害、保持機體內環境的穩定方面起重要作用[3]。腸黏膜是食物進入腸道后最先接觸的部位，食物經過胃腸道的消化和營養吸收，使得小腸暴露在大量抗原中[4-5]，食物中已有的或經過胃腸道消化產生的免疫活性肽，調節著腸黏膜免疫屏障，使其處于正常的生理狀態。目前，發現許多腸道疾病都會引起腸黏膜屏障功能的變化，如急性腸炎、腸易激綜合癥、潰瘍性結腸炎等[6]。因此，飲食對于維持腸道最佳的免疫功能起著重要作用[5,7]，通過食療的方法改善腸道屏障功能成為可能。

1965年，Delfour等[8]發現κ-酪蛋白的特定位點經凝乳酶切斷，生成不溶的副κ-酪蛋白和三氯乙酸可溶的親水性酪蛋白巨肽兩部分。目前，Kim等[9]已經通過基因工程改造酵母細胞，使其能夠產生人體酪蛋白巨肽（human caseinomacropeptide，hCMP）。這些可溶性多肽含有較多的糖鏈，于是被稱為糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白來源的此類多肽都統稱為酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。它是乳清中重要的一種活性多肽，是由64 個氨基酸組成，含有較多的支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA），而缺少芳香族氨基酸的特殊結構。對于CGMP的制備工藝，目前常用的制備CGMP的方法有沉淀法[10]、雙水相法[11]、酶交聯法[12]以及層析法[13]。其中，沉淀法會引起部分蛋白質變性；雙水相法和酶交聯法制備成本高；層析法吸附率高，并且不會引起蛋白質變性，因此適用于大規模生產。前期實驗通過離子交換層析的方法，采用價格較低的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂從乳清粉中分離CGMP，并對分離過程中的工藝條件進行優化，尋找了一條過程簡單、成本較低、純化效果較好、唾液酸含量高的CGMP制備的工藝路線[14]。

通過對CGMP的結構分析，發現CGMP中主要以O-糖苷結合2 種中性糖鏈和3 種酸性糖鏈，90%以上的結合糖鏈都含唾液酸[15]。結構決定性質，CGMP的特殊氨基酸組成和配糖體，決定了其對機體能夠產生一系列的生物學活性[16-19]，如果將CGMP中的唾液酸消化掉，則許多生物學活性就會減弱或消失。目前，CGMP作為保健營養品（nutraceuticals）引起了科研工作者越來越多的興趣。Yun等[20]通過研究CGMP對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激的脾臟細胞產生免疫球蛋白的影響，發現CGMP誘導IgA的濃度升高，說明CGMP能夠促進正常機體B淋巴細胞的增殖，上調機體的體液免疫功能。Li等[21]于2004年通過體外實驗發現CGMP能夠增加人的吞噬細胞U937的吞噬活性，并且能夠促進其增殖。另外，賈玉臣等[22]研究發現，乳源CGMP誘導調節CD4+細胞的活性，能夠促進小腸上皮的彌散性和促炎細胞因子如IFN-γ、IL-4等的增加。

綜上所述，尋找并研究一些食源性生物活性物質，在維持機體腸黏膜免疫系統的平衡以及新藥和保健品的研制和開發方面具有重要價值。因此，本實驗利用流式細胞儀、石蠟切片蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫熒光技術，檢測分析CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性以及十二指腸上皮內淋巴細胞（intraepithelial lymphocyte，IEL）和固有層IgA+漿細胞數量變化的影響，探討CGMP對小鼠腹腔免疫細胞和腸黏膜免疫系統的影響，這為CGMP作為功能性食品添加劑以及新藥的創制提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 周齡昆明雌性小鼠96 只，SPF級，體質量（25.53±1.65）g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.2 材料與試劑

牛乳源CGMP 新西蘭Tatua公司；啤酒酵母 天津商業大學菌種保藏室；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma 公司；多聚賴氨酸天津華生生物科技有限公司；二甲苯（分析純） 天津市佳興化工玻璃儀器工貿；蘇木精染液、伊紅染液 天津市久圣醫療電子儀器有限公司；所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

FACS Calibur流式細胞儀（雙激光配置） 美國BD公司；MODULYOD-230冷凍干燥機 鄭州長城科工貿有限公司；YD-355電腦切片機、TD-B組織烤片機、YD-A組織攤片機 金華市益迪醫療設備廠；DS-5MC光學顯微鏡、TE2000熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物及分組

表1 實驗動物分組Table 1 Grouping of mice in experiments

6 周齡小鼠適應性喂養2 周后根據體質量將小鼠隨機分為3 組，隨后按照表1所示的分組和灌胃劑量分別對小鼠進行連續灌胃，并在實驗開始2、4、6、8 d后分別在各組中隨機選取8 只小鼠進行腹腔吞噬細胞吞噬活性和腸道免疫細胞活性的研究。實驗期間，各組小鼠自由采食、飲水。

1.4.2 不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性的影響

1.4.2.1 啤酒酵母培養和酵母干粉的制備

將活化后的啤酒酵母接種到土豆平板培養基，28 ℃培養3 d，3 mL無菌水輕輕沖洗獲得酵母細胞，將收集的酵母細胞500 r/min離心1 min，棄去沉淀，上清液8 000 r/min離心1 min獲得大小均一的酵母細胞。無菌水懸浮后－20 ℃冷凍，最后置于冷凍干燥機中制成凍干粉，4 ℃干燥保存。

1.4.2.2 小鼠血清的制備

眼球摘除法取血，室溫靜置30 min，4 ℃靜置2 h，3 000×g、4 ℃離心10 min獲得小鼠血清，分裝后，－80 ℃貯存，作為熒光標記啤酒酵母細胞的調理素。

1.4.2.3 熒光標記啤酒酵母細胞

取120 mg啤酒酵母凍干粉，與6 mL 0.01 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）緩沖液溶解混勻后，80 ℃水浴加熱15 min滅活。將滅活后的菌體細胞8 000 r/min離心2 min，棄上清液，將得到的沉淀用6 mL DMSO配制的FITC溶液（0.1 mg/mL）懸浮混勻，室溫避光孵育1 h，離心后去上清液，無菌PBS洗滌沉淀4 次，得到熒光標記的酵母細胞。

1.4.2.4 啤酒酵母細胞熒光標記率的檢測

利用流式細胞儀檢測熒光標記酵母的標記率，熒光標記率大于99.9%的說明標記合格，最后將得到的熒光標記合格的酵母細胞用無菌PBS調整至終濃度為2×109個/mL菌懸液，4 ℃避光保存備用。在進行吞噬實驗前將熒光標記啤酒酵母細胞懸液與小鼠血清按照體積比為1∶1的比例室溫孵育60 min，無菌PBS調整至終濃度為1×109個/mL。

1.4.2.5 小鼠腹腔吞噬細胞的分離與吞噬

頸椎脫臼處死各組小鼠，用75%的酒精涂抹腹部，向腹腔注射5 mL的無菌PBS，輕揉腹部1～2 min后，剪開腹部，吸取3 mL腹腔液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5 mL的PBS混勻，然后加入50 μL上述制備好的熒光標記的酵母細胞，使其中熒光酵母和吞噬細胞個數比為20∶1。混勻后倒入24 孔培養板中，置于37 ℃恒溫箱中孵育40 min，棄去孔內液體，加入4 ℃預冷的PBS溶液0.5 mL，輕輕晃動沖洗1 次，然后再加入0.5 mL、4 ℃預冷的PBS抽吸吹打，混勻后置于冰上待測。

1.4.2.6 流式細胞術檢測不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬功能的影響

利用流式細胞儀檢測每個分組中8 只小鼠吞噬細胞樣本的吞噬活性，每份樣本獲取10 000 個細胞。以前向散射角（forward scatter，FSC）和側向散射角（side scatter，SSC） 建立FSC-SSC點圖，設“門”以圈定待測的吞噬細胞群，檢測“門”內吞噬細胞的FITC熒光強度，獲取FL1-H熒光信號柱狀圖。利用Cell Quest program 6.0對獲取的細胞數據進行分析，首先以未加熒光標記酵母細胞的吞噬細胞樣品作為陰性對照，設“門”M1表示沒有吞噬熒光標記酵母的吞噬細胞群；接著以熒光標記的酵母細胞為陽性對照，上機檢測，獲得FL1-H熒光信號柱狀圖并記錄其平均熒光強度（M）；然后以此平均熒光強度M作為一個標準單位，按照此標準單位的倍數依次設門M2、M3、M4……Mn，分別表示吞噬1、2、3……n-1個熒光標記酵母細胞的吞噬細胞群。最后根據設“門”的個數來確定n值，并按照式（1）計算吞噬細胞的吞噬率。

式中：M1代表M1門內的細胞數，即沒有吞噬酵母的吞噬細胞數。

按照式（2）計算吞噬指數。

式中：M2代表M2門內的吞噬細胞數，即吞噬1 個酵母細胞的吞噬細胞個數；Mn代表Mn門內的吞噬細胞數，即吞噬n－1個酵母細胞的吞噬細胞數。

1.4.3 不同劑量的CGMP對小鼠十二指腸上皮內 淋巴細胞和固有層IgA漿細胞的影響

1.4.3.1 小鼠十二指腸組織的固定

各組小鼠頸椎脫臼處死后迅速取胃下5 cm處十二指腸組織2 cm，放入包埋盒中，做好標記，置于4%的福爾馬林溶液中固定48 h。

1.4.3.2 小鼠十二指腸組織石蠟切片的制備和HE染色及IEL計數

參照文獻[23-24]中的方法制備各組小鼠十二指腸組織的石蠟切片以及HE染色。

在每張HE染色切片上，隨機選擇10個視野進行計數，每個視野內單核的非上皮細胞被認為是淋巴細胞，統計腸IEL數。

1.4.3.3 免疫熒光標記及計數

1）將上述制備的常規石蠟切片脫蠟至水。2）抗原修復：將洗滌后的組織切片放入加熱煮沸后的檸檬酸鈉（pH 6.0）抗原修復液中，中火加熱20 min，冷卻至室溫，取出組織切片放入PBS緩沖液中室溫孵育10 min。3）熒光標記：將2 mg/mL的FITC-IgA單抗溶液與pH 7.4的PBS溶液按照1∶50（V/V）倍進行稀釋；將稀釋的單抗溶液滴加到切片組織上，37 ℃恒溫孵育2 h進行熒光標記。4）封片：取出切片組織，PBS浸洗3 次，每次10 min；擦去載玻片上多余的水分，滴加甘油進行封片。5）鏡檢計數：熒光顯微鏡對組織切片中IgA+細胞進行計數，每張切片隨機計數10 個視野。

1.5 數據分析

用SPSS11.5對數據進行方差分析和t檢驗分析，校驗水平為α=0.05；其中，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；數據用±s表示。

2 結果與分析

2.1 不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性的影響

2.1.1 不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬指數的影響

圖1 不同劑量CGMP對吞噬細胞吞噬指數的影響Fig.1 Effect of different doses of CGMP on phagocytic index of phagocytes

由圖1可知，實驗期間灌胃CGMP組（G1和G2）小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬指數隨著灌胃天數的增加而增大，并且在灌胃第6天G2組小鼠吞噬細胞的吞噬指數顯著高于G1組（P＜0.01），兩個劑量組小鼠都在灌胃第8天吞噬細胞的吞噬指數達到最大值；而在灌胃第2天和第4天，G1和G2組與對照組G0相比小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬指數差異并不顯著（P＞0.05）；但從灌胃第6天開始，G2組吞噬指數顯著高于G0組（P＜0.01）；第8天G1和G2組小鼠吞噬細胞吞噬 指數與對照組相比均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.1.2 不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬率的影響

圖2 不同劑量的CGMP對腹腔吞噬細胞吞噬率的影響Fig.2 Effect of different doses of CGMP on phagocytic rate of phagocytes

由圖2可知，在灌胃第2天，G1和G2組與G0組相比小鼠吞噬細胞的吞噬率均升高，其中G2組與G0組相比差異顯著（P＜0.05）；灌胃第4天， G1和G2組小鼠吞噬細胞吞噬率降至最低，且與G0組無顯著差異，隨后升高，并在第8天升至最高值。另外，從灌胃第6天開始，G2組小鼠吞噬細胞吞噬率顯著高于G0和G1組（ P＜0.05）；而在灌胃第8天，G1和G2組小鼠吞噬細胞吞噬率均顯著高于G0組（P＜0.05），且G2組小鼠腹腔吞噬細胞吞噬率也顯著高于G1組（P＜0.01）。

2.2 不同劑量的CGMP對小鼠十二指腸IEL的影響

圖3 不同劑量的C GMP對小鼠腸上皮內淋巴細胞數量的影響Fig.3 Effect of different doses of CGMP on the number of IEL in mice

由圖3可知，從灌胃第2天開始兩個劑量的CGMP都能顯著增加小鼠十二指腸IEL的數量（P＜0.01）；并且隨著灌胃天數的增加，G1組小鼠十二指腸IEL數量也隨之增加，在第8天達到最大值，而G2組小鼠十二指腸IEL數量于第4天達到高峰，隨后則無顯著增加。

2.3 不同劑量的CGMP對小鼠十二指腸固有層中IgA+漿細胞的影響

圖4 不同劑量的CGMP對小鼠固有層IgA+漿細胞數量的影響Fig.4 Effect of different doses of CGMP on the number of IgA+plasma cells in mice

由圖4可知，從灌胃第2天開始，兩個劑量的CGMP都能顯著引起小鼠十二指腸固有層中IgA+漿細胞數量的增加（P＜0.01），且隨著灌胃時間的延長IgA+漿細胞數量也不斷增加，在第8天達到最大值。

3 討 論

3.1 建立流式細胞儀檢測腹腔吞噬細胞吞噬活性方法的目的和意義

腹腔吞噬細胞能夠非特異性的吞噬進入人體內的病原體，衰老病變細胞，參與抗原識別與遞呈，生成多種細胞因子，對于機體抵御病原體的入侵起著重要的作用。因此，檢測腹腔吞噬細胞的吞噬活性對于藥物的篩選和功能性食品的開發具有重要的意義。然而，傳統的檢測吞噬細胞吞噬活性的方法如雞紅細胞和酵母細胞的吞噬實驗具有耗時長、受人的主觀因素影響比較大、觀察的數量較少等缺點。采用流式細胞儀來檢測吞噬細胞活性不僅靈敏快速，而且高通量檢測的特點很大程度上提高了檢測效率，減少了人 為主觀因素的影響，所以該方法受到了人們的廣泛關注，隨之發展起來的技術方法也很多。李煜等[25]通過流式細胞術檢測小鼠腹腔吞噬細胞吞噬熒光微球的 活性，并與傳統的雞紅細胞法作比較，雖然吞噬熒光微球的方法檢測效果較好，但是檢測成本相對高昂；而黃瓊[26]和金齊 力[27]等分別通過吞噬熒光標記大腸桿菌和結核分枝桿菌的方法檢測了吞噬細胞的吞噬活性，但是由于這些細菌的細胞較小容易被吞噬細胞表面受體黏附且熒光標記率低，從而影響檢測結果的準確性。

Miliukien?等[28]2005年通過吞噬熒光標記啤酒酵母的方法來檢測外周血中中性粒細胞 的吞噬活性，但是由于沒有排除未標記的酵母細胞對實驗的影響造成檢測結果誤差較大。因此本實驗在總結前人的研究經驗基礎上對檢測方法進行了相關改進，使其更能夠準確反映吞噬細胞的吞噬活性。將啤酒酵母細胞作為吞噬顆粒，這是因為其細胞比較大，菌體大小差別小，同時，FITC熒光標記率高，可以達到99.97%，這為后續研究的準確性提供了基礎。另外，利用流式細胞儀的高通量特點進一步提高了研究的準確性和可信度。因此，在本實驗結合流式細胞術建立了一種具有靈敏快捷、重復性好、準確率高等優點的檢測吞噬細胞活性的方法，并運用該方法評價了不同劑量的CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性的影響。

3.2 CGMP對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬活性的影響

吞噬細胞包括中性粒細胞和單核-吞噬細胞，這些細胞是執行固有免疫作用的效應細胞，可及時清除入侵體內的病原微生物，在機體早期抗感染免疫過程中發揮重要作用。吞噬細胞不僅參與機體的特異性免疫反應和非特異性免疫反應，而且是兩種免疫反應聯系的“橋梁細胞”，在與多種病原微生物識別與結合過程中，它可以誘導I-A抗原的高表達，能夠通過受體與病原體等抗原異物的結 合作用來主動吞噬、殺傷和消化病原微生物并分泌多種細胞因子。研究發現，吞噬細胞吞噬內毒素是體內清除內毒素的主要途徑，當吞噬細胞的吞噬功能受到抑制，導致體內清除內毒素或病原微生物的功能減弱，會引起機體抵抗能力下降[29]。因此吞噬細胞在調節和維持腹腔環境的穩定，增強固有免疫方面具有關鍵作用。

Stutas等[30]發現，κ-酪蛋白經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化產生的多肽能夠顯著提高促絲裂原誘導的人淋巴細胞的增殖；而且來源于κ-酪蛋白的胰蛋白酶酶解產物Phe-Phe-Ser-Asp-Lys在體外能夠促進抗體的產生并且增強鼠和人吞噬細胞的吞噬活性。另外，Li等[21]在體外通過CGMP與人吞噬細胞U937作用，發現低劑量的CGMP能顯著增強吞噬細胞的吞噬活性并促進其增殖。而在本實驗中，我們通過動物實驗，發現G1和G2組小鼠吞噬細胞的吞噬指數和吞噬率呈劑量-效應和時間-效應關系；而G1和G2組吞噬指數于灌胃第8天顯著接近且都高于G0組，這可能是因為灌胃8 d后G1和G2組小鼠吞噬細胞的吞噬能力均增加到最高，所以造成劑量效應無顯著差異；另外，G1和G2組小鼠的吞噬率于灌胃第4天出現低谷且與G0組無顯著差異，這可能是因為灌胃前期CGMP對吞噬能力的正向調節作用有所抑制，而在吞 噬指數的影響實驗中也可以看到相似的實驗結果，即在灌胃前期吞噬指數的增加不顯著；因此，在體內CGMP同樣能夠顯著增強腹腔吞噬細胞的吞噬能力，而且隨作用時間的延長作用效果越明顯，這與Li等[21]的體外研究結果基本一致。

3.3 CGMP對小鼠十二指腸IEL的影響

腸黏膜免疫屏障主要由腸道相關淋巴組織構成。腸上皮內淋巴細胞是黏膜免疫的主要效應位點，淋巴細胞歸巢的主要部位，在誘導和調節腸黏膜免疫應答中起著重要作用。IEL是腸黏膜免疫系統中最先接觸抗原的免疫活性細胞，它長期與腸道正常菌群、病原微生物接觸，在腸黏膜的抗感染免疫、保持腸上皮細胞的完整性及調節對外來抗原的免疫應答方面均有重要作用。發生IBD時，腸黏膜的天然免疫和特異性免疫系統均有免疫異常的表現，而淋巴細胞參與的IBD異常免疫主要為特異性（適應性）免疫反應。現在認為，腸黏膜免疫系統對腸腔常駐菌群的耐受異常是IBD發病機制的原因之一[31]。因此，IEL對于維持腸黏膜的免疫耐受方面起著重要作用，通過調節IEL來達到增強IBD患者對腸道菌群的 免疫耐受性可能是改善或者治療IBD的重要方法。本實驗結果表明CGMP可能具有這方面的功能，但仍需要進一步的研究進行驗證。另外，CGMP誘導IEL的顯著增加可能的途徑是CGMP由腸上皮M細胞傳遞給PP結內的樹突細胞，刺激PP結T淋巴細胞增殖，通過腸系膜淋巴結到達黏膜免疫的效應位點，主要是CD8+細胞；CD8+細胞為殺傷性T細胞，通過與腸上皮細胞的相互作用和細胞因子的分泌，從而能夠維持腸黏膜機械屏障和免疫屏障功能，抵御腸道中的毒素和病原微生物的侵襲[11]。因此，本研究表明了CGMP在維持腸黏膜免疫屏障方面具有重要作用，長期灌胃CGMP能夠誘導IEL的數量增加，這也提示CGMP可能具有誘導腸黏膜產生獲得性免疫應答作用。

3.4 CGMP對十二指腸固有層內IgA+漿細胞的影響

小腸固有層是腸黏膜免疫的效應位點，固有層IgA漿細胞分泌的sIgA進入腸腔，對維持局部抗體的有效水平，抵御腸道病原微生物的侵襲，拮抗細菌定殖、黏附，以及中和腸腔毒素等方面均起重要作用。本實驗的結果表明，CGMP能夠誘導小鼠十二指腸固有層IgA+漿細胞數量的增加。CGMP能夠誘導小鼠十二指腸固有層IgA+漿細胞數量的增加的可能機制包括以下幾個方面：首先是CGMP干預后，腸道菌群發生變化尤其是腸道益生菌如雙歧桿菌數量顯著增加的結果[32]；其次，也可能是由于CGMP通過PP結的M細胞進入黏膜淋巴組織后，經APC加工遞呈給B細胞，在T細胞和細胞因子，尤其是TGF-β影響下發生 IgM-IgA類型轉換，然后經傳出淋巴管遷移到腸系膜淋巴結（mesenteric lymph node，MLN），隨后分裂和分化，最后離開MLN，經胸導管進入血循環，在歸巢受體介導下遷移至腸黏膜固有層，分化為成熟的IgA+漿細胞，促使固有層IgA+漿細胞的增加[15]；然后，可能由于CGMP直接通過腸道上皮層進入固有層，刺激CD4+T淋巴細胞分泌細胞因子，促使IgA+漿細胞的分化[15]。最后還有一種可能，由于腸黏膜固有層免疫應答以Th2型為主，CGMP可能直接通過腸道固有層的樹突細胞的捕獲進入固有層，通過與Th2淋巴細胞的相互作用，促使Th2細胞可分泌多種細胞因子如TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，IL-6可協同誘導固有層中的sIgA+B細胞分化成為IgA+漿細胞[22]。因此，本研究的結果提示CGMP能夠誘導腸黏膜產生獲得性體液免疫應答，這為開發CGMP作為黏膜疫苗的載體或佐劑來誘導局部黏膜免疫反應來提高分泌進入腸腔的sIgA量，從感染的源頭阻止病原菌的侵入提供了有力的科學依據。

4 結 論

本實驗建立了一種新的利用流式細胞儀測定吞噬細胞吞噬活性的方法，該方法具有靈敏、快捷、重復性好準確率高的優點。通過該方法檢測灌胃不同劑量CGMP小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬能力發現：CGMP能夠顯著增強吞噬細胞的吞噬能力；而且灌胃劑量為120 μg/d時的作用效果優于灌胃劑量為30 μg/d時的作用效果；另外，灌胃時間越長，CGMP對吞噬細胞吞噬能力的作用效果越明顯。因此，這提示CGMP可以作為功能性食品添加劑，增強機體的非特異性免疫細胞的功能。

實驗發現小鼠灌胃CGMP后，小腸黏膜免疫反應的效應位點中腸上皮內淋巴細胞和固有層IgA+漿細胞數量與對照組相比顯著增加（P＜0.01），這說明CGMP能夠誘導小鼠腸上皮內淋巴細胞和固有層IgA+漿細胞的增加。因此，CGMP可以作為功能性食品添加劑誘導腸黏膜體液免疫反應，從而分泌多種抗炎因子以增強腸道的抗炎作用。

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Effect of Casein Glycomacropeptide on Phagocytic Cells and Intestinal Mucosa Immune Cells in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Guang-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effect on peritoneal immune cells and intestinal mucosal barrier in mice. Methods: After being intragastrically given CGMP at doses of 30 and 120 μg/d, respectively, 96 female Kunming mice were tested for phagocytic activity, intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) subpopulations and the number of IgA+plasma cells in the lamina propria by flow cytometry, hematoxylin and eosin (HE) staining and immunofluorescence, respectively. Results: CGMP administration to mice resulted in a significa nt increase in phagocytic activity in a dose- and time-dependent manner. Compared with the control group, CGMP administration also resulted in a significantly higher percentage of intraepithel lal lymphocytes (IEL) in the duodenum and a significantly greater number of IgA+plasma cells in the la mina propria (P ＜ 0.01). Conclusion: CGMP can enhance phagocytic activity, induce intestinal mucosal immune response and enhance the intestinal mucosal barrier function.

casein glycomacropeptide; intestinal mucosal barrier; phagocytic activity; intestinal intraepithelial lymphocytes; IgA+plasma cells

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0234-07

10.7506/spkx1002-6630-201409046

2013-12-18

國家自然科學基金面上項目（30771524；31071522）

葉雷（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質研究與腸道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為食源性生物活性物質與腸道健康、蛋白質（酶）資源研究與開發。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn