霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調節活性及在小腸中的吸收分布

郝 冉，王正明，查學強，潘利華，羅建平

霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調節活性及在小腸中的吸收分布

郝 冉，王正明，查學強，潘利華，羅建平*

（合肥工業大學生物與食品工程學院，中草藥與功能食品研究所，安徽 合肥 230009）

目的：研究霍山石斛多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）的小鼠腸黏膜免疫調節活性以及在小腸內的吸收分布。方法：通過溴化氰活化法對DHP進行熒光標記，檢測熒光標記前后的腸黏膜免疫調節活性；通過口服和離體小腸培養以及Peyer’s結細胞培養，用激光共聚焦顯微鏡檢測DHP在小腸內的吸收分布以及與Peyer’s結細胞的結合。結果：DHP在質量濃度為25、50、100 μg/mL和200 μg/mL時，其腸黏膜免疫調節活性分別提高到對照組的112.8%、131.1%、137.6%和160.5%，熒光標記不改變DHP腸黏膜免疫活性；DHP在體內和體外均可被小腸吸收，分 布于腸黏膜固有層內，并可與Peyer’s結內細胞結合。結論：DHP具有腸黏膜免疫調節活性，可以通過Peyer’s結細胞被小腸吸收，并分布于固有層內。

霍山石斛；多糖；熒光標記；腸黏膜；分 布

腸黏膜免疫系統是體內最大和最復雜的免疫系統，由組織化的淋巴組織和分散的淋巴細胞組 成，其中Peyer’s結是一種重要的腸黏膜組織化淋巴組織，是腸黏膜免疫反應的誘導位點[1]。研究表明，中藥及其多糖口服后能夠通過小腸吸收[2-3]，調節腸黏膜免疫，進而通過細胞因子及淋巴細胞歸巢影響系統免疫[4-6]。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng）是一種名貴藥食同源植物，具有保肝、明目、益 胃的功能[7]，多糖是其主要活性成分[8]。 藥理學研究表明，霍山石斛多糖具有抗氧化[9-10]、抗白內障[11-12]、抗糖基化[13]、抗肝損傷和肝纖維化[14]、抗疲勞[15]和免疫調節[16-18]等活性，但關于霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調節活性和口服后在小腸內的吸收分布還不清楚。本實驗采用溴化氰活化法對霍山石斛均一多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）進行熒光標記，檢測其腸黏膜免疫調節活性，并在體內和體外分析DHP在小腸內的吸收分布及與小腸細胞的結合，以期闡明霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調節活性及在小腸中的吸收分布，為霍山石斛多糖功能性食品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛均一多糖DHP按本實驗室Zha Xueqiang等[17]的方法制備，分子質量為6 400 u。SPF級雄性昆明小鼠（6～8 周，（20±2）g）購自安徽醫科大學實驗動物中心。

Sephadex G25 美國Sigma公司；改良型RPMI-1640培養基 美國Thermo Fisher公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；Alamar Blue試劑盒 上海貝博試劑公司；熒光素胺 美國Aldrich公司；冰凍切片包埋劑O.C.T 美國Sakura公司。

1.2 儀器與設備

CT15RT高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；MCO-17AIC CO2培養箱 日本Sanyo公司；Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo Fisher公司；CM1900冷凍切片機 德國Leica公司；TCS SP5激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光標記DHP的制備

用溴化氰活化法對DHP進行熒光標記[19]。將1 mL DHP溶液（20 mg/mL）與0.2 mL溴化氰（cyanogens bromide，CNBr）溶液（50 mg/mL）混合，邊振蕩邊加入0.25 mol/L NaOH維持pH 11以上15 min。反應混合液利用Sephadex G25（1.0 cm ×15 cm）以pH 8.0的0.2 mol/L硼酸鈉緩沖液洗脫，流速1.5 mL/min。收集含多糖的組分，立即加入2 mg熒光素胺室溫下避光反應18 h。反應所得亮黃色溶液利用Sephadex G25（1.0 cm×15 cm）將熒光標記的多糖與游離的熒光素胺分離，洗脫液為不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），pH 8.0，流速1.5 mL/min。用分部收集器收集，每管2 mL，測定每管中糖含量和熒光素胺含量。回收同時含多糖和熒光素胺的組分，即為熒光標記的多糖fl-DHP。多糖含量用苯酚-硫酸法測定[20]，熒光素胺含量按文獻[19]方法測定。

1.3.2 腸黏膜免疫調節活性

多糖的腸黏膜免疫調節活性測定按照Hong等[4]的方法。小鼠處死后，70%酒精浸泡消毒。無菌取小腸，用Hank’s平衡鹽溶液清洗干凈，小心從小腸壁上分離Peyer’s結，置于冷的含有體積分數5%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中。用注射器活塞通過4 層紗布磨碎Peyer’s結，離心取細胞，用含有5%胎牛血清的Hank’s平衡鹽溶液洗滌 2次，每次1 500 r/min離心10 min。將細胞重懸于1 mL完全培養基中，用臺盼藍染色計活細胞數，調整細胞濃度為2×106個/mL。將Peyer’s結細胞懸液加入96 孔培養板中，每孔180 μL，每孔加入不同質量濃度的DHP或fl-DHP 20 μL（終質量濃度分別為0、25、50、100、200 μg/mL），每組5 個平行。置5% CO2、37 ℃增濕環境下培養5 d。培養結束后，離心取Peyer’s結細胞條件培養基。骨髓細胞懸液按照文獻[4]制備。將骨髓細胞懸液加入96 孔板中，每孔100 μL，另加50 μL的完全培養基以及50 μL Peyer’s結細胞條件培養基，置5% CO2、37℃孵箱中培養6 d。培養結束前5 h，每孔加入20 μL的Alamar Blue試劑，繼續培養至結束，利用Varioskan Flash酶標儀在激發波長為544 nm、發射波長為590 nm波長處測定熒光強度。多糖的腸黏膜免疫調節活性用相對于空白對照組（僅加PBS）的骨髓細胞增殖表示。

為了檢測DHP與fl-DHP對骨髓細胞增殖是否具有直接促進作用，用終質量濃度為0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP直接培養小鼠骨髓細胞，用Alamar Blue試劑檢測細胞增殖情況。

1.3.3 DHP在體內的小腸吸收

取雄性昆明小鼠9 只，隨機分為3 組。在灌胃處理前，小鼠禁食12 h，自由飲水。空白對照組每只小鼠灌胃0.5 mL PBS，熒光素胺對照組每只小鼠灌胃0.5 mL 5 μg/mL熒光素胺溶液，fl-DHP處理組每只小鼠灌胃0.5 mL 100 μg/mL fl-DHP溶液。分別在灌胃0、0.5 h和3 h后處死小鼠，取出回腸段，用PBS小心的沖洗干凈后，液氮冷凍。將小腸修剪成合適大小后，加適量的O.C.T制作冰凍切片，利用激光共聚焦顯微鏡在激發波長和發射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

1.3.4 DHP在體外的小腸吸收

取雄性昆明小鼠9 只，隨機分為3 組，禁食12 h，自由飲水。小鼠處死后，取出回腸段，小心用PBS沖洗干凈。仔細的將腸腔翻轉，使黏膜層暴露在外部，將腸段一端用絲線扎緊，向腸腔內注入適量的PBS后扎緊另一端。將處理好的回腸段分別置于含PBS或5 μg/mL熒光素胺或100 μg/mL fl-DHP的RPMI-1640培養基中，37 ℃培養0、0.5 h和3 h。培養結束后取出腸段，用PBS清洗干凈后液氮冷凍。制作冰凍切片，用激光共聚焦顯微鏡在激發波長和發射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

1.3.5 DHP體外與Peyer’s結細胞的結合

按照1.3.2節的方法制備Peyer’s結細胞懸液，調整細胞濃度為2×106個/mL。將1 mL P eyer’s結細胞懸液加入24 孔板中，加PBS或5 μg/mL熒光素胺或100 μg/mL fl-DHP后37 ℃培養1 h。離心取細胞，用PBS洗滌兩遍之后，用200 μL PBS重懸。將細胞懸液滴在載玻片上，晾干后置于4%甲醛溶液中固定1 h以上，用激光共聚焦顯微鏡在激發波長和發射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

為檢測DHP對fl-DHP與Peyer’s結細胞結合的抑制作用，先用含有100 μg/mL DHP的培養基37 ℃條件下培養Peyer’s結細胞1 h，離心取細胞，用PBS洗滌兩遍之后，再用含有100 μg/mL fl-DHP的培養基培養1 h，制作細胞涂片，用激光共聚焦顯微鏡在激發波長和發射波長分別為488 nm和530 nm處觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 fl-DHP的制備與分離

經溴化氰活化后的DHP與熒光素胺反應，所得混合溶液用Sephadex G25分離，測定洗脫組分中總糖和熒光素胺含量并繪制洗脫曲線。如圖1所示，同時含有多糖和熒光素胺的組分即為fl-DHP。

圖1 CNBr-活化的DHP與熒光素胺反應產物洗脫曲線Fig.1 Elution profile of the reaction products of CNBr-activated DHP with fluoresceinamine

2.2 DHP與fl-DHP的腸黏膜免疫調節活性分析

圖2 DHP與fl-DHP腸黏膜免疫調節活性Fig.2 Intestinal mucosal immunomodulating activities of DHP and fl-DHP

盡管不同終質量濃度0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP對骨髓細胞的增殖沒有直接的促進作用，但DHP和fl-DHP均能通過Peyer’s結細胞顯著促進骨髓細胞的增殖，并且具有劑量依賴效應（圖2）。當DHP在質量濃度為25、50、100、200 μg/mL時，骨髓細胞增殖分別提高到112.8%、131.1%、137.6%和160.5%。fl-DHP與DHP的腸黏膜免疫調節活性沒有顯著差異，表明熒光標記不影響DHP的腸黏膜免疫調節活性。

2.3 DHP在體內的小腸吸收

圖3 DHP在體內的小腸吸收（×630）Fig.3 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

如圖3所示，PBS對照組中各時間段均未在小腸內檢測到熒光，用熒光素胺灌胃0.5 h和3 h后能夠在腸道內檢測到熒光，表明熒光素胺可以通過小腸吸收。用fl-DHP對小鼠灌胃處理0.5 h后，即可在腸道固有層觀察到熒光，在灌胃3 h后，能檢測到較強的熒光。由于fl-DHP中不含游離的熒光素胺，且溴化氰活化法標記的多糖已被證明在生理條件下可以保持穩定[21]，因此結果表明DHP可以經小腸吸收，并分布于腸道固有層。

2.4 DHP在體外的小腸吸收

圖4 DHP在體外的小腸吸收（×630）Fig.4 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

由圖4可知，PBS體外培養的小鼠小腸不同時間段均未檢測到熒光，用熒光素胺體外培養小鼠小腸，在0.5 h和3 h后能夠檢測到熒光存在，表明熒光素胺可以通過離體小腸吸收。在對離體小腸用fl-DHP處理0.5 h后，即可在腸道固有層檢測到熒光，處理3 h后，能檢測到較強的熒光，結果與體內實驗一致。

2.5 DHP體外與Peyer’s結細胞的結合

圖5 DHP在體外與Peyyeerr’s結細胞的結合（×630）Fig.5 Binding of DHP to Peyer’s patch cells in vitro (×630)

圖6 熒光標記細胞占觀察的Peyyeerr’s 結細胞的比例Fig.6 Ratio of fluorescent labeled cells in Peyer’s patch cells

圖5、6顯示DHP與Peyer’s結細胞的結合情況。用PBS處 理的Peyer’s結細胞未檢測到熒光，而熒光素胺處理Peyer’s結細胞可以檢測到少量的熒光，表明熒光素胺可以與Peyer’s結內某些細胞結合。用fl-DHP處理Peyer’s結細胞，發現大量Peyer’s結細胞可以與fl-DHP結合。利用DHP預先處理Peyer’s結細胞后再與fl-DHP結合，結果顯示結合細胞的數量有所下降，表明DHP可以競爭性抑制fl-DHP與Peyer’s結細胞的結合，進一步證明DHP可以與Peyer’s結某些細胞結合。

3 結 論

本實驗對霍山石斛均一多糖DHP腸黏膜免疫調節活性以及在小腸中的吸收分布進行了初步的研究。結果表明DHP可以通過Peyer’s結刺激骨髓細胞的增殖；溴化氰活化法對DHP進行熒光標記不改變DHP的腸黏膜免疫調節活性。體內和體外實驗表明，DHP可以與Peyer’s結內的某些細胞結合，通過小腸吸收，并分布于腸道固有層。但是DHP的吸收機制以及DHP與Peyer’s結細胞結合的種類與方式還需要進一步研究。

[1] MOWAT A M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens[J]. Nature Reviews Immunology, 2003, 3(4): 331-341.

[2] 鄭年新, 阮金秀, 張永祥, 等. 六味地黃多糖在小鼠體內的吸收[J].中國藥理學通報, 2000, 16(4): 403-405.

[3] 高其品, 陳慧群, 王坤, 等. 銀耳多糖在大鼠體內的吸收、分布和排除[J]. 中國藥學雜志, 2002, 37(3): 205-207.

[4] HONG T, MATSUMOTO T, KIYOHARA H, et al. Enhanced production of hematopoietic growth factors through T cell activation in Peyer’s patches by oral administration of Kampo (Japanese herbal) medicine, “Juzen-Taiho-To”[J]. Phytomedicine, 1998, 5(5): 353-360.

[5] GRONHAUG T E, KIYOHARA H, SVEAASS A, et al. Beta-D-(1→4)-galactan-containing side chains in RG-I regions of pectic polysaccharides from Biophytum petersianum Klotzsch. contribute to expression of immunomodulating activity against intestinal Peyer’s patch cells and macrophages[J]. Phytochemistry, 2011, 72(17): 2139-2147.

[6] KIYOHARA H, MATSUMOTO T, YAMADA H. Intestinal immune system modulating polysaccharides in a Japanese herbal (Kampo) medicine, Juzen-Taiho-To[J]. Phytomedicine, 2002, 9(7): 614-624.

[7] 吳胡琦, 羅建平. 霍山石斛的研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2010, 21(1): 208-211.

[8] 李勝立, 陳程, 楊思林, 等. 霍山石斛類原球莖免疫調節活性的有效部位及其毒理安全性評價[J]. 藥物評價研究, 2012, 35(5): 321-327.

[9] 查學強, 王軍輝, 潘利華, 等. 石斛多糖體外抗氧化活性的研究[J].食品科學, 2007, 28(10): 90-93.

[10] WANG Shu, WEI Fengjuan, CAI Yongping, et al. Anti-oxidation activity in vitro of polysaccharides of Dendrobium huoshanense and Dendrobium moniliforme[J]. Agricultural Science and Technology, 2009, 10(6): 121-124.

[11] LUO Jianping, DENG Yuanyuan, ZHA Xueqiang. Mechanism of polysaccharides from Dendrobium huoshanense on streptozotocininduced diabetic cataract[J]. Pharmaceutical Biology, 2008, 46(4): 243-249.

[12] 李秀芳, 鄧媛元, 潘利華, 等. 霍山石斛多糖對糖尿病性白內障大鼠眼球晶狀體組織抗氧化作用的研究[J]. 中成藥, 2012, 34(3): 418-421.

[13] PAN Lihua, FENG Baojun, WANG Junhui, et al. Structural characterization and anti-glycation activity in vitro of a water-soluble polysaccharide from Dendrobium huoshanense[J]. Journal of Food Biochemistry, 2013, 37(3): 313-321.

[14] PAN Lihua, LU Jun, LUO Jianping, et al. Preventive effect of a galactoglucomannan (GGM) from Dendrobium huoshanense on selenium-induced liver injury and fibrosis in rats[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(7/8): 899-904.

[15] 夏云建, 余剛. 霍山石斛多糖干預對力竭運動小鼠BUN、MDA、BLA、肝糖原影響的研究[J]. 湖北體育科技, 2012, 31(6): 650-653.

[16] ZHA Xueqiang, LUO Jianping, JIANG Shaotong. Induction of Immunomodulating cytokines by polysaccharides from Dendrobium huoshanense[J]. Pharmaceutical Biology, 2007, 45(1): 71-76.

[17] ZHA Xueqiang, LUO Jianping, LUO Shuizhong, et al. Structure identification of a new immunostimulating polysaccharide from the stems of Dendrobium huoshanense[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 69(1): 86-93.

[18] HSIEH Y S, CHIEN C, LIAO S K, et al. Structure and bioactivity of the polysaccharides in medicinal plant Dendrobium huoshanense[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(11): 6054-6068.

[19] GLABE C G, HARTY P K, ROSE S D. Preparation and properties of fluorescent polysaccharides[J]. Analytical Biochemistry, 1983, 130(2): 287-294.

[20] DUBIOS M, GILLS K A, HAMILTOM J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[21] ARNOSTI C. Fluorescent derivatization of polysaccharides and carbohydrate-containing biopolymers for measurement of enzyme activities in complex media[J]. Journal of Chromatography B, 2003, 793(1): 181-191.

Intestinal Mucosal Immunomodulating Activity of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Absorption and Distribution in Small Intestine

HAO Ran, WANG Zheng-ming, ZHA Xue-qiang, PAN Li-hua, LUO Jian-ping*
(Institute of Traditional Chinese Medicine and Functional Foods, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefe i 230009, China)

Objective: To investigate the intestinal mucosal immunomodulating activity of a homogeneous Dendrobiu m huoshanense polysaccharide (DHP) and its absorption and distribution in the small intestine of mice. Methods: DHP was labeled with fuoresceinamine via cyanogen bromide activation, and the intestinal mucosal immunomodulating activity was detected. A confocal laser scanning microscope was used to detect the absorption of DHP and binding to P eyer’s patch cells via oral administration, in vitro small intestine co-culture and co-culture with Peyer’s patch cells. Results: Th e intestinal mucosal immunomodulating activity was increased by 12.8%, 31.1%, 37.6% and 60.5% when compared with the control at DHP conce ntrations of 25, 50, 100 and 200 μg/mL, respectively. Fluorescent labeli ng had no effect on t he intestinal mucosal immunomodulating activity of DHP. It could not only be absorbed through the small intestine in vivo and in vi tro, but also could distribute in intestinal lamina propria and bind to certain cells in Peyer’s patches. Conclusion: DHP possesses intestinal mucosal immunomodulating activity and can be absorb ed through Peyer’s patch cells of the small intestine.

Dendrobium huoshanense; pol ysaccharides; fluorescent labeling; intestinal mucosa; distribution

Q94

A

1002-6630（2014）09-0256-04

10.7506/spkx1002-6630-201409050

2013-06-19

安徽省科技攻關計劃項目（12010402088）；國家自然科學基金青年科學基金項目（21006019）；國家自然科學基金面上項目（31271814）

郝冉（1988—），女，碩士，研究方向為中草藥與功能食品。E-mail：haoran43253@163.com

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與分子營養。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn