基于“回陽救逆”功效附子對小鼠心電圖影響的“效—毒”關聯評價

王 懿孫 蓉

（1山東省中醫藥研究院，濟南，250014；2山東中醫藥大學，濟南，250355）

基于“回陽救逆”功效附子對小鼠心電圖影響的“效—毒”關聯評價

王 懿1，2孫 蓉1

（1山東省中醫藥研究院，濟南，250014；2山東中醫藥大學，濟南，250355）

目的：基于“回陽救逆”功效研究附子對小鼠心電圖的影響，探討附子藥效和毒性的關聯性。方法：灌胃給予小鼠不同劑量的附子各組分后，觀察小鼠的心電圖變化，檢測血清中AST、LDH、cTn-I的含量以及心體比值變化。結果：附子各組分引起心電圖QRS間期延長和S-T段抬高，血清AST、LDH、cTn-I的含量依劑量呈現不同程度的升高，以醇提組分的升高幅度顯著，從藥效劑量的9 g開始呈現出一定毒副作用。結論：附子藥效劑量會引起小鼠心電圖室早的改變和心肌損傷，缺血的血清心肌酶含量升高，必須重視附子藥效劑量下毒副作用的監測工作，研究在“回陽救逆”功效下的藥效作用發揮和毒性作用表達的關聯性，使藥效作用發揮達到最優話，毒副作用產生降到最低值，使附子的臨床應用更具安全性和有效性。

回陽救逆；附子；心電圖；效—毒；關聯評價

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，是溫里藥中常用藥物之一，早在《神農本草經》中就有記載，稱其為“百藥之長”[1]。附子為“通行十二經純陽之要藥”，又為“回陽救逆第一品藥”[2]，故在我國傳統醫學中被廣泛應用。歷代醫家將其做為亡陽虛脫證的首選藥物，更有扶陽派醫家興起了中醫獨具特色的“火神派”，廣泛推廣附子“回陽救逆”之功。在現代臨床應用中，附子主要用于救治急性心肌梗死所致的休克狀態，具有強心、抗心律失常、抗心肌缺血等藥理作用。與此同時，應用附子后的臨床不良反應報道也與日俱增，主要表現在對心臟和神經的損害，且發病急，病情重，對心臟的直接損害作用顯著，引起心律失常，更有嚴重者發展為室顫危及生命。附子既能強心，增強心功能；又能對心肌細胞造成損害，引起一系列的心律失常，歸其原因是附子中的主要成分烏頭堿，其既是發揮藥效的物質基礎也是產生毒性的主要成分。中藥的毒性具有一些固有特點，有毒中藥的毒性應當放在功效中進行綜合的評價和科學的認知，不能孤立地“就毒性論毒性”。因此，在臨床使用附子時應如何保證其療效，又科學評判其毒性，建立一個“功效—毒性”相關聯的評價體系就顯得尤為重要。所以，本次研究將基于附子“回陽救逆”功效，以心電圖變化和心臟毒性指標為依據，探討附子“效—毒”關聯性，進而合理闡釋中醫理論中“藥以治病，因毒為能”的合理性與科學性。

1 材料

1.1 藥材 附子藥材購自北京同仁堂（毫州）飲片有限責任公司（批號：201232732-S），經山東省中醫藥研究院林惠彬研究員鑒定為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，按2010年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）附子項下檢查，符合各項規定。

1.2 動物 KM小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，適齡、健康，共190只，購自山東大學實驗動物中心，動物合格證號：scxk（魯）2009001。

1.3 儀器與試劑 AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），UV2100型紫外分光光度計（上海尤尼柯公司），HH-S恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫療儀器廠），GL-20G-Ⅱ型高速離心機（上海安亭儀器廠），BL-420s生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；AST試劑盒（批號：20120819），LDH試劑盒（批號：20120321），cTN-I試劑盒（批號：20120711）均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 樣品及制備方法 附子水提組分：稱取附子藥材1000 g，加10倍量水浸泡，加熱回流提取2次，每次1.5 h，16層紗布過濾，取藥液濃縮至實驗所需濃度。批號：20120628。

附子醇提組分：稱取附子藥材1000 g分別用4倍量85%乙醇加熱回流提取4次，每次2h，過濾、合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至實驗所需濃度。批號：20120627。

附子全組分：稱取附子藥材100 g，粉碎，過80目篩。臨用時加水配制成所需濃度。批號：20120628。

2.2 實驗動物分組 取KM小鼠160只，雌雄各半，按體重隨機分為16組，即正常對照組、附子水提組分5個劑量組、附子醇提組分5個劑量組、附子全組分5個劑量組，每組10只。

2.3 實驗劑量設計 根據2010版《中國藥典》記載的附子用量為3～15 g，以3 g為劑量區間，每個組分分別設置5個劑量組。水提組分按生藥量計算為1.95、1.56、1.17、0.78、0.39 g·kg-1（分別相當于15、12、9、6、3 g附子生藥材），標記為FS-1組，FS-2組，FS-3組，FS-4組，FS-5組；醇提組分按生藥量計算為1.95、1.56、1.17、0.78、0.39 g·kg-1（分別相當于15、12、9、6、3 g附子生藥材），標記為FC-1組，FC-2組，FC-3組，FC-4組，FC-5組；全組分按生藥量計算為1.95、1.56、1.17、0.78、0.39 g·kg-1（分別相當于15、12、9、6、3 g附子生藥材），標記為FQ-1組，FQ-2組，FQ-3組，FQ-4組，FQ-5組；均按25 mL·kg-1鼠重體積灌胃，正常對照組灌服等體積蒸餾水。

2.4 實驗方法 取KM小鼠，按5 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用BL-420s生物機能實驗系統對小鼠進行心電測量，描述正常ECG后，按25 m L·kg-1灌胃給予不同劑量附子，分別于藥后5、10、30、60、90、120 min觀測心電圖，記錄P波時間、QRS間期、PR間期、QT間期變化及ST段的偏移值。待小鼠清醒后，繼續按25mL·kg-1灌胃給予不同劑量附子2d，于末次藥后60 min，眼眶靜脈叢取血，3000r／min離心10 min，取血清，測定血清中AST、LDH、cTN -I含量。處死動物，取臟器，計算臟體比值。

2.5 統計學方法 數據用（ˉx±s）表示，采用SPSS 11.5統計軟件對各組參數進行單因素方差分析，進行組間比較，P＜0.05為具有統計學意義。

3 結果

3.1 附子對小鼠心電圖的影響

3.1.1 對P波時間的影響 給藥前，各個劑量組P波時間均在正常值范圍內。給藥后，水提組分和全組分各個劑量組在不同時間點均未出現明顯的延長，與給藥前比較沒有統計學意義；醇提組分的1.95 g·kg-1組在120 min內P波時間先延長后縮短，1.56 g·kg-1組持續增高，分別與給藥前比較有不同的統計學意義，其余劑量組較給藥前自身也有一定變化，但沒有統計學意義。P波是心房除極波，其延長說明其除極緩慢，預試著心房出現問題，其縮短提示可能QRS波的提前掩蓋了部分P波；因此，附子的醇提組分在高劑量時會對心房的活動產生一定影響。結果見圖1。

圖1 附子醇提組分對小鼠心電圖P波的影響

3.1.2 對QRS間期的影響 給藥前，各個劑量組QRS間期均在正常值范圍內。給藥后，水提組分和全組分各個劑量組在不同時間點變化不明顯，沒有出現明顯的延長改變。但醇提組分的1.95、1.56和1、17 g ·kg-1組在120 min內出現了QRS間期延長的改變，與給藥前自身間期比較有統計學意義。在臨床上，QRS波群代表了心室的除極全過程，出現寬大畸形的改變時提示室早的發生，在心電圖上表現為間期的延長。從實驗結果看，附子醇提組分在藥效劑量9 g及以上的等效劑量下，小鼠心電圖出現室早現象。結果見圖2。

圖2 附子醇提組分對小鼠心電圖QRS間期的影響

圖3 附子醇提組分對小鼠心電圖QT間期的影響

3.1.3 對PR間期的影響 給藥前，各個劑量組PR間期均在正常值范圍內。給藥后，水提組分和全組分各個劑量組在不同時間點變化不明顯，120min內沒有出現明顯延長。醇提組分的附子各個組分PR間期起伏變化，其中醇提組分的變化幅度最為顯著，但三個組分的變化在120min內與給藥前自身比較均沒有統計學意義。PR間期是心房除極開始至心室開始除極的一段時間間隔，其時間延長可見于房室傳導阻滯，但從結果看，各個劑量下的變化沒有明顯的統計學意義，提示在該藥效劑量下未出現房室傳導阻滯的毒副作用。

3.1.4 對QT間期的影響 給藥前，各個劑量組QT間期均在正常值范圍內。給藥后，水提組分和全組分各個劑量組QT間期沒有顯著延長；醇提組分1.17g· kg-1組的延長程度最大，持續到藥后120min，其次1.95、1.56g·kg-1組在不同時間點也出現延長趨勢，分別與給藥前自身比較有不同的統計學意義。QT間期作為臨床上判斷惡性心律失常是否發生的關鍵指標，反應了心室整個活動，因此醇提組分9～12g藥效劑量范圍內可能有心律失常的毒副作用出現。結果見圖3。

3.1.5 對S-T段的影響 給藥前，各個劑量組S-T段均在正常值范圍內。給藥后，較給藥前自身比較，水提組分和全組分的S-T段抬高不明顯，醇提組分9～15g劑量出現了S-T段的抬高，其中1.95g·kg-1組從藥后5min開始有統計學意義（P＜0.05），持續到藥后120min；1.56g·kg-1組藥后10min出現統計學意義（P＜0.05），120min時基本回到給藥前水平；1.17g ·kg-1組在藥后30～60min內也有一定統計學意義。心電圖S-T段改變是反映心肌缺血性損傷程度較可靠的指標，其升高或者降低的幅度直接反應了心肌缺血的嚴重程度，在劑量為1.17g·kg-1時發現了S-T段的抬高，說明該劑量下附子醇提組分開始引起小鼠心肌缺血。數據見表1。

表1 附子醇提組分對正常小鼠心電圖S-T段的影響（mv，±s，n＝10）

表1 附子醇提組分對正常小鼠心電圖S-T段的影響（mv，±s，n＝10）

注：與自身給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別給藥前給藥后5min10min30min60min90min120min 1.95g·kg-10.087±0.0300.172±0.027*0.195±0.032*0.299±0.056**0.324±0.033***0.216±0.061**0.164±0.044*1.56g·kg-10.092±0.0310.112±0.0430.213±0.034*0.222±0.057**0.245±0.051**0.148±0.043*0.100±0.031 1.17g·kg-10.108±0.0240.113±0.0270.176±0.0330.243±0.041**0.207±0.021*0.182±0.0270.113±0.019 0.78g·kg-10.088±0.0270.098±0.0450.105±0.0220.122±0.0340.108±0.0310.109±0.0230.093±0.031 0.39g·kg-10.091±0.0220.103±0.0310.097±0.0270.105±0.0310.115±0.0440.103±0.0510.089±0.063

3.2 附子不同組分對正常小鼠心臟毒性生化指標影響

3.2.1 水提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標 水對照組AST、LDH、cTn-I指標水平均在正常范圍內。給藥后，各劑量組小鼠血清AST、LDH、cTn-I值均有不同程度的升高，與水對照組比較，最高劑量組的AST和LDH含量升高具有統計學意義（P＜0.05），提示在高劑量下附子水提組分會損傷心肌細胞，使胞漿中的酶溢出到細胞外，引起相應酶含量的升高。數據見表2。

3.2.2 醇提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標 水對照組AST、LDH、cTn-I指標水平均在正常范圍內。給藥后，各劑量組小鼠血清AST、LDH、cTn-I值均有不同程度的升高，且從FC-4組（相當于人日用量9 g）開始，三個指標的升高顯著，與水對照組比較按劑量均具有統計學意義（P＜0.001、P＜0.01、P＜0.05），呈現劑量依賴性升高，cTn-I指標的升高提示了此時的心肌細胞出現不可逆的損傷，發生心肌梗死的可能性增大。數據見表3。

表2 附子水提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

表2 附子水提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

注：與水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

劑量AST活性（U／L）LDH濃度（U／L）cTn-I濃度（pg／m L）水對照組45.40±12.05 442.94±89.74 349.31±115.83 FS-1組61.24±11.57*534.78±90.51*432.69±100.11 FS-2組58.75±13.63 523.24±97.02 421.27±106.45 FS-3組50.43±12.41 502.53±101.23 413.94±118.83 FS-4組48.62±10.01 483.24±99.56 401.27±116.45 FS-5組48.13±12.92 470.90±119.36 399.02±105.25

表3 附子醇提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

表3 附子醇提組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

注：與水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

劑量AST活性（U／L）LDH濃度（U／L）cTn-I濃度（pg／mL）水對照組45.40±12.05 442.94±89.74 349.31±115.83 FC-1組71.32±16.24***525.00±76.76***758.35±127.34***FC-2組61.02±23.46**518.04±136.76**656.00±165.01***FC-3組54.96±10.06*475.54±88.51*632.91±95.49**FC-4組44.17±8.01 462.24±60.88 550.94±151.87*FC-5組47.99±11.80 452.32±130.80 538.97±160.11*

3.2.3 全組分對正常小鼠心臟毒性生化指標 水對照組AST、LDH、cTn-I指標水平均在正常范圍內。給藥后，各劑量組小鼠血清AST、LDH、cTn-I值均有不同程度的升高，與水對照組比較，FQ-1組和FQ-2組血清AST、LDH含量升高顯著，均有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05），說明該劑量下附子會引起細胞膜通透性增加，使胞漿中的酶透出到血液中引起血清中酶含量的升高。數據見表4。

表4 附子全組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

表4 附子全組分對正常小鼠心臟毒性生化指標（±s，n＝10）

注：與水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

劑量AST活性（U／L）LDH濃度（U／L）cTn-I濃度（pg／m L）水對照組45.40±12.05 442.94±89.74 349.31±115.83 FQ-1組52.33±7.24**488.23±77.60**572.42±70.21*FQ-2組49.28±9.41*475.24±61.03*564.32±66.72 FQ-3組48.04±9.33 457.30±77.97 532.81±75.45 FQ-4組48.06±5.50 452.99±66.39 398.82±82.68 FQ-5組47.91±9.19 447.21±64.72 344.10±71.96

3.3 附子不同組分對正常小鼠心體比值的影響 水對照組的心體比值在正常值范圍內，給藥后，水提組分的心體比值雖有升高，但與水對照組比較沒有統計學意義；醇提組分的心體比值升高明顯，與水對照組比較，從1.17 g·kg-1（相當于人用量9 g）開始向高劑量呈現劑量依賴性；全組分僅1.95 g·kg-1下出現顯著升高，與水對照組比較有統計學意義（P＜0.05）。提示，醇提組分對心肌細胞產生一定損害。數據見表5。

表5 附子不同組分對正常小鼠心體比值的影響（±s，n＝10）

表5 附子不同組分對正常小鼠心體比值的影響（±s，n＝10）

注：與水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

0.491±0.052 0.491±0.052 0.491±0.052 1.95 g·kg-1組0.515±0.039 0.558±0.077**0.524±0.076*1.56 g·kg-1組0.501±0.040 0.541±0.096*0.518±0.065 1.17 g·kg-1組0.498±0.043 0.512±0.062*0.518±0.089 0.78 g·kg-1組0.493±0.037 0.489±0.047 0.516±0.061 0.39 g·kg-1組劑量水提組分醇提組分全組分水對照組0.481±0.057 0.488±0.034 0.491±0.042

4 討論

心電圖（ECG）記錄了心臟在每個心動周期中生物電變化，能夠即時反應患者心臟功能，因此是臨床中用于各種心臟疾病診斷的重要指標，尤其是對多種心律失常的判斷具有十分重要的參考意義，例如心房波P波，當其間期增大，則提示心房內可能出現傳導阻滯；心室波QRS波群，其延長改變提示室內傳導阻滯或者室性期前收縮；T波的高聳和S-T段的改變則更進一步的提示心肌缺血和梗死的改變。這些指標的病理性改變為臨床治療提供切實可靠的依據，同時在結合相應的其他檢測結果可以做成最好的治療方案，為臨床患者減輕痛苦。從本次實驗結果中，醇提組分對小鼠心電圖的P波時間、QRS間期、PR間期、QT間期以及S-T段出現了不同程度延長改變，尤其以1.17～1.95 g·kg-1劑量之間影響顯著，并且以QRS間期延長和S-T段的抬高為最主要的改變，說明在藥效劑量9～15 g之間，發揮“回陽救逆”功效的同時，對小鼠的心臟產生一定毒副作用，表現為室早發生時心電圖QRS間期寬大畸形和心肌梗死出現早期S-T段的顯著抬高。查閱相關附子毒性實驗研究報道，發現附子對心臟的毒性主要表現在引起心律失常，也是以頻發性的室早為最常見[3-7]。因此，應用有毒中藥附子治療疾病的同時要關注早期心電圖各波形的改變，關注藥效劑量下毒副作用的表達，才能更好的監測附子不良反應的發生，找到功效和毒性的關聯性，合理應用藥物為臨床治療疾病服務。

心肌酶是心肌細胞內的酶類物質，具有催化心肌細胞代謝和調節心肌細胞電活動的作用。心肌酶的釋放量是心肌損害的主要標志，在一定程度上反映心肌病變程度。天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartateaminotransferase，AST）主要分布在心肌上，當心肌細胞損傷時，細胞膜的完整性遭到破壞，大量的酶釋放入血，使得血清中AST含量明顯升高。LDH作為胞漿中的酶，也是只有在細胞受損時才可能大量溢出到胞外，LDH的增加反映細胞膜損傷的同時，也是心肌缺血的早期診斷指標[8]。從實驗結果中分析得出：附子15 g等效量下，均對心肌細胞產生一定的毒副作用，表現在AST的升高，其中醇提組分的損傷最為明顯，不僅表現在AST和LDH的升高，還表現cTn-I含量的顯著性升高，并且毒性劑量從9 g等效量發生。說明在藥效的高劑量下，應用附子有可能引起心肌缺血的毒副作用，所以臨床應用有毒藥物附子時要早期檢測這些毒性指標的改變，盡早調整用量，使附子的藥效得到最大程度的發揮為患者減輕痛苦。

有毒中藥的毒性具有一些固有的特點，中藥毒性及其評價與功效密切相關，其毒性可以被認知、控制和駕馭，才可以被安全、有效地在臨床中正確使用[9]。本次實驗中，依據有毒中藥附子的藥典記載安全用藥范圍進行“藥效-毒性”相關性研究，結果證明附子醇提組分的毒副作用顯著，會引起心肌缺血和梗死的心電圖和心肌酶譜的改變。因此，建立基于附子有效物質基礎和毒性物質基礎的“毒性—功效”的相關性研究模式，不孤立地評價毒性，而是放在功效的背景下綜合評價，平衡利弊才是有毒中藥科學應用的關鍵。本次實驗對附子“回陽救逆”功效下的“毒性—功效”的關聯性評價研究中，還沒有結合模型去探討，是我們下一步研究的重點和方向；同時，在中藥安全性評價中積極引進毒理學先進技術和手段，并建立符合中醫藥特點的中藥毒性評價的新思路、新方法，也是研究中需重視的技術方法[10]。只有這樣，像附子這樣的有毒中藥的毒性才可以被認知、被控制和駕馭，有毒中藥在臨床實踐中才可以更加安全、更加合理、更具療效的應用。

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（2014-01-06收稿 責任編輯：洪志強）

Efficacy-Toxicity Relevancy of Fuzi regarding its Effect of Restoring Yang and Saving from Collapse

Wang Yi1，2，Sun Rong1
（1 Shandong Research Academy of TCM，Jinan 250014，China；2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

Objective：To evaluate the impact of Fuzion ECG result of mice to explore the relevancy between efficacy and toxicity of Fuzi regarding its effect of restoring yang and saving from collapse.Methods：Different doses of Fuzi were given to mice by gavage，then observed the changes of ECG，measured AST，LDH，cTn-I and the change of heart body ratio.Results：Various Fuzi extract can lengthen interphase of QRS，elevate the segment of S-T，and increase AST，LDH and cTn-I according to the doses.alcohol extracts raised most significantly，and presented side effects at dose of 9 g.Conclusion：Fuzi’efficacy dose will cause ECG changes and myocardial injury，so monitoring toxicity below the efficacy doses should be paid attention to.To research the relevancy between efficacy and toxicity regarding the“Restoring yang and saving from collapse”effect can minimize toxicity and give full play to efficacy，so that Fuzi has better safety and efficacy.

Restoring yang and saving from collapse；Fuzi；Electrocardiogram；Efficacy-toxicity；Relevance evaluation

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.007

國家973計劃中醫基礎理論專項課題（編號：2009CB322802）

王懿，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與毒理

孫蓉，女，研究員，博導，博士，研究方向：中藥藥理與毒理，電話：（0531）82949843，E-mail：sunrong107＠163.com