黃芩苷對人肺腺癌LTEP-A2細胞的抑制作用及機制研究

韋小白董競成

（1復旦大學附屬華山醫院靜安分院，上海，200040；2復旦大學附屬華山醫院，上海，200040）

黃芩苷對人肺腺癌LTEP-A2細胞的抑制作用及機制研究

韋小白1董競成2

（1復旦大學附屬華山醫院靜安分院，上海，200040；2復旦大學附屬華山醫院，上海，200040）

目的：研究觀察黃芩苷對人肺腺癌LTEP-A2細胞株體外的抑制作用及相關機制。方法：采用不同濃度的黃芩苷干預人肺腺癌LTEP-A2細胞株，用CCK-8方法檢測不同時間點不同濃度的黃芩苷對肺癌細胞增殖的抑制程度，接著用細胞劃痕試驗和Transwell小室侵襲試驗觀察黃芩苷對肺癌細胞體外遷移、侵襲能力的影響；用Western blot進一步檢測黃芩苷干預后肺癌細胞MMP-2、MMP-9、TGF-β的表達的變化。結果：黃芩苷能明顯抑制肺癌細胞增殖；能不同程度降低肺癌細胞的遷移、侵襲、體外劃痕愈合能力，呈濃度依賴性；黃芩苷能不同程度下調MMP-2、MMP-9表達，其中以高濃度效果明顯，中濃度居中，低濃度作用稍弱，與空白對照組比較，組間差異有統計學意義，P＜0.05；對肺癌細胞TGF-β的表達沒有顯著影響，與對照組比較，P＞0.05。結論：黃芩苷能不同程度地降低肺癌增殖遷移侵襲的能力，其機制可能是通過下調MMP-2、MMP-9的表達從而對肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲發揮抑制作用。

黃芩苷；增值；遷移；LTEP-A2細胞；MMP-2；MMP-9

黃芩苷（Baicalin）是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來的黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，如：抗菌、抗氧化、誘導干細胞分化等[1-3]。近年來，隨著對黃芩苷的深入研究，發現黃芩苷還能夠抑制黏液表皮樣癌腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，具有顯著的抗腫瘤作用[4]。目前，對黃芩苷抗腫瘤作用的實驗研究主要集中在人前列腺癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳腺癌、結腸癌和惡性黑色素瘤等惡性腫瘤[5-6]，但是關于黃芩苷作用于肺癌細胞株的研究較少，如僅有少量報道黃芩提取物能夠誘導SPC-A-1細胞凋亡，其機制可能與黃芩提取物能上調caspase -3表達和下調survivin基因表達有關[7]。既然黃芩苷對肺癌細胞株SPC-A-1有作用，那么對肺癌細胞株LTEP-A2又有著怎樣的作用？除了誘導細胞凋亡，黃芩苷是否還可通過其他途徑發揮作用，目前仍不是十分清楚。為了進一步明確黃芩苷的抗腫瘤作用，本研究觀察其對LTEP-A2細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并進行相關分子機制的初步探討，以期為臨床應用黃芩苷治療肺癌提供科學的理論依據。

1 材料和方法

人肺癌細胞株LTEP-A2購自中國科學院上海細胞生物研究所。藥物黃芩苷購自南京青澤醫藥公司，純度：99.1%。小牛血清、RPMI1640培養液購自Gibco公司；CCK8試劑購自日本同仁化學研究所；β-actin抗體為Santa Cruz公司產品；MMP-2、MMP-9、TGF-β抗體為Cell signaling technology公司產品；HRP標記羊抗兔二抗為北京康為世紀生物科技有限公司產品。實驗共分為4組，分別為50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黃芩苷組，空白對照組加等量0.5%二甲基亞砜（DMSO）。

1.1 CCK-8法 取對數生長期細胞按1×105／mL接種于96孔板內，設3個復孔，加入不同濃度黃芩苷，總體積100μL，培養24、48、72、96 h后，每孔加入CCK -8溶液10μL，繼續培養2 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（A），計算細胞增殖抑制率，繪制細胞增殖抑制曲線。增殖抑制率計算公式：增殖抑制率（%）＝（A對照組-A實驗組）／A對照組×100%。

1.2 Transwell小室侵襲試驗 采用24孔板Transwell小室進行，包被有膠原基質的Matrigel濾膜孔徑為8 μm。分別將50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黃芩苷處理的肺腺癌LTEP-A2細胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105個／孔接種于上層小室，下層小室加入10%胎牛血清（FBS）培養液，37℃孵育24 h，取出濾膜，用棉拭子輕輕擦掉濾膜上層的細胞，將濾膜用PBS淋洗，固定、染色（參照細胞遷移實驗相關步驟），置于甲醇固定10 min，高倍鏡下隨機選取5個視野，計數遷移至濾膜下層的細胞，實驗重復3次。抑制率（%）＝（實驗組侵襲細胞的數量／對照組侵襲細胞的數量）× 100%。

1.3 Transwell小室細胞遷移試驗 將Fibronectin 200倍稀釋至終濃度50μg／mL，在Transwell小室內加入100μL，小室外加入400μL，4℃過夜。準備受試細胞懸液：取對數生長期細胞，吸取細胞培養液，無鈣磷的PBS液沖洗，胰蛋白酶消化細胞，用含1%FBS細胞培養液收集和重懸細胞，調整細胞密度為1×105／mL。吸取transwell中Fibronectin，PBS沖洗一次。將Transwell小室放入24孔培養板中，在小室外加入400μL含10%FBS完全培養液，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中孵育6 h，PBS漂洗3次，4%PAF固定30 min，PBS漂洗3次，Cooomassieblue室溫染色適當時間。倒置顯微鏡下1×10物鏡計數貼附于小室多孔膜上的總細胞數（No），棉簽擦去小室多孔膜上方細胞，計數殘留在小室多孔膜下方的細胞數（N1）。按以下公式計算細胞遷移率：細胞遷移率＝N1／No×100%。每孔計數5個視野。

1.4 細胞劃痕試驗 將肺腺癌LTEP-A2細胞株傳代于玻片上，生長至100%匯合后，用無菌吸頭在玻片上劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈被刮下的細胞，每孔加纖連蛋白后分別加入50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黃芩苷，對照組加等量0.5%二甲基亞砜（DMSO），孵育96 h，取出玻片，低倍視野下觀察細胞傷口愈合情況。隨機選取5個視野，計數遷移細胞的數量，以此表示細胞的遷移活性。實驗平行重復3次。計算：細胞遷移抑制率（%）＝（實驗組遷移細胞數／對照組遷移細胞數）×100%。

1.5 MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白表達的Westernblot檢測 收集50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黃芩苷處理96 h的LTEP-A2細胞及對照組細胞，用PBS洗滌，加入5倍體積含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r／min離心15 min，棄去沉淀，上清液為細胞總蛋白。用Bradford法測定蛋白含量。100℃變性10 min，每孔加等量的蛋白樣品進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別加入兔抗人MMP-2、MMP-9、TGF-β抗體，4℃孵育過夜。以TBS漂洗5 min×3次，加入羊抗兔HRP標記二抗，室溫孵育1 h后TBS漂洗5 min×3次，用化學發光法檢測后分析結果。

1.6 統計學處理 實驗數據用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析。計量資料用（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞體外增殖的影響（*提示P＜0.05）

2 結果

2.1 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞增殖抑制作用

CCK-8方法檢測黃芩苷對LTEP-A2細胞增殖的影響，結果發現不同濃度的黃芩苷對肺癌細胞有著不同程度的抑制作用，其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之。隨著時間的推移，不同濃度的黃芩苷作用于肺癌細胞24 h后開始顯示出抑制作用，48 h后作用顯著，96 h后達到高峰，與對照組比較，差異有統計學意義，P＜0.05（如圖1）。

2.2 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞遷移作用的影響 將不同濃度的黃芩苷預處理96 h后進行劃痕實驗、transwell小室遷移實驗。結果如圖2所示：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌細胞的體外愈合能力，其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之，與對照組比較，差異有統計學意義，P＜0.05（如圖2、圖3）。

圖2 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞體外劃痕試驗的影響

圖3 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞體外劃痕試驗影響統計圖（*P＜0.05）

2.3 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞侵襲作用的影響 將不同濃度的黃芩苷預處理96 h后進行Transwell小室侵襲實驗。結果如圖所示：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌細胞的侵襲能力，其中以其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之，與對照組比較，差異有統計學意義，P＜0.05（如圖4）。

2.4 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞MMP-2、MMP -9、TGF-β蛋白表達的影響 將不同濃度的黃芩苷預處理96 h后進行Westernblot檢測。結果表明：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度的下調LTEP-A2肺癌細胞MMP-2、MMP-9表達，其中以其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100 μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）稍弱，與對照組比較，差異有統計學意義，P＜0.05。而黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞TGF-β蛋白表達沒有影響，與對照組比較，P＞0.05（如圖5、圖6）。

圖4 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞遷移侵襲能力的影響

圖5 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞MMP-2，MMP-9的影響

圖6 黃芩苷對肺腺癌LTEP-A2細胞TGF-β的影響

3 討論

肺腺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在我國，肺腺癌死亡居惡性腫瘤首位[8]。由于肺腺癌細胞具有快速侵襲、遷移的特征，因此它是肺癌預后最差的病理類型之一[9-10]。因此，如何有效抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲，是改善預后、控制病情進展的關鍵。

黃芩性寒、味苦，歸肺、心、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。主治壯熱煩渴，肺熱咳嗽，黃疸，目赤腫痛，胎動不安，癰腫療瘡等。關于黃芩可治腫瘤的功效，早在《神農本草經》就載黃芩具有“主諸熱黃疸，腸癖泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”的功效。而黃芩苷為傳統中藥黃芩的主要有效成分之一，目前研究發現黃芩苷對多種腫瘤均有較好的作用。如王英俊等[6]用不同濃度的黃芩苷處理結腸癌細胞株SW-1116后，發現50，100，200μmol／L黃芩苷能夠誘導結腸癌細胞株SW-1116凋亡，凋亡率與劑量呈正相關，并隨藥物濃度和作用時間而變化。細胞周期分布呈現G1期比例逐漸增高，出現典型的凋亡峰。說明黃芩苷能誘導結腸癌細胞凋亡，并明顯抑制癌細胞增殖，具有抗腫瘤作用。現有研究表明黃芩苷可以通過多種途徑發揮抗腫瘤作用，如抑制腫瘤新生血管生成從而降低腫瘤細胞的增值遷移[11]，如通過降低環氧化酶-2的表達抑制前列腺素E2的產生，進而阻斷前列腺素合成酶對腫瘤細胞的促進作用[12]。而關于黃芩苷對于肺癌細胞遷移、侵襲能力的作用及機制研究，目前缺乏相關報道。本研究結果顯示，黃芩苷對LTEPA2細胞增殖具有明顯的抑制作用。同時，經過黃芩苷的干預后，肺癌細胞的侵襲、遷移能力與對照組比較都有不同程度的降低。且這種抑制作用具有時間和劑量依賴性，這和已有報道黃芩苷能抑制人肝癌細胞的侵襲能力[13]一致。

基質金屬蛋白酶（MMPs）對基底膜中細胞外基質的降解是腫瘤浸潤和轉移的重要步驟之一[14-15]。MMPs家族是一類內源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9是該家族的重要成員，這兩種酶的主要功能為降解明膠和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜膠原，在細胞與基質間的黏附中起著重要的作用，MMP-2、MMP-9的表達與腫瘤侵襲關系密切。有研究顯示，在肺癌細胞中，MMP-2、MMP-9高表達可促進該腫瘤的浸潤、轉移[16]。

TGF-β在乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中均有表達，是預測相關腫瘤的易感性及腫瘤預后的重要細胞因子[17-21]。有研究表明，TGF-β可促進前列腺癌的侵襲轉移[11]。既然MMPs和TGF -β在肺癌的轉移復發中如此重要，而黃芩苷能顯著抑制肺癌細胞的遷移、侵襲，那么用黃芩苷干預后這些細胞因子是否也發生改變？本實驗研究發現，與對照組比較，黃芩苷組的MMP-2、MMP-9的表達下降，TGF-β表達不變。為了進一步驗證黃芩苷與MMP-2、MMP-9與TGF-β的關系，我們分別用不同濃度的黃芩苷干預肺癌細胞，結果發現高濃度的黃芩苷組MMP-2、MMP-9表達最低，低濃度組較高濃度組表達高，中濃度組居中，而不同濃度的黃芩苷對TGF-β表達沒有影響。

總之，本研究發現黃芩苷能不同程度地降低肺癌增殖遷移侵襲的能力，其機制可能是通過下調MMP-2、MMP-9的表達從而對肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲發揮抑制作用。

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（2013-10-10收稿 責任編輯：王明）

Study on Inhibition Effect and Mechanism of Baicalin on LTEP-A2 Cells in Lung Cancer Patients

Wei Xiaobai1，Dong Jingcheng2
（1 Jingan Branch of Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China；2 Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China）

Objective：To explore the inhibition effects and mechanism of baicalin on LTEP-A2 cells in vitro of lung cancer patients.Methods：Human pneumonicadenocarcinoma cell line LTEP-A2 was cultured with different dose of baicalin for different periods of time. Cell proliferation was assayed by using Cell Counting Kit-8，and further in vitro study including tumor cell migration and invasion，wound healing assays were performed.Besides，MMP-2，MMP-9，TGF-β，which were related to the migration and metastasis potential in lung cancer cell lines were detected by western blot.Results：Baicalin inhibited the proliferation of LTEP-A2 cells in a time and concentrationdependent manner.In tumor cell migration and invasion test，wound healing assays etc.showed significantly decreased migration，invasion in baicalin-treated cell groups vs control tumor cells.Further study showed that MMPs decreased after baicalin-treated.The higher doses of baicalin，the lower level of MMP-2／MMP-9.However，baicalin did not have a significant effect on the TGF-β.Conclusion：Baicalin inhibits the proliferation and migration of lung cancer LTEP-A2 cells，possibly by decreasing the expression of MMP-2，MMP-9 in part.

Baicalin；Proliferation；Metastasis；LTEP-A2 cells；MMP-2；MMP-9

R285.5；R734.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.025

董競成（1959—），男，博士，博士生導師，教授，復旦大學附屬華山醫院中西醫結合研究所，E-mail：jcdong2004＠126.com

韋小白（1981—），女，博士，復旦大學附屬華山醫院靜安分院，E-mail：weixiaobai2005＠163.com